張 京 董 琦 全瑩禹

(1 海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心普外腫瘤外科，海南省?？谑?570312；2 海南省人民醫(yī)院兒科，海南省海口市 570311)

結(jié)腸炎是一種由多種原因引起的慢性、復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎癥，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫因素在結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。結(jié)腸受外源性神經(jīng)和內(nèi)源性神經(jīng)共同支配，神經(jīng)元是腸壁神經(jīng)系統(tǒng)和高級(jí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互聯(lián)系的紐帶，可動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)結(jié)腸的功能和維持結(jié)腸的正常生理狀態(tài)[1-3]。 游離狀態(tài)下的腸道可通過誘導(dǎo)處于增殖狀態(tài)的T淋巴細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，直接抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，同時(shí)減少致炎性Th(Th1、Th2、Th17)和具有免疫抑制性的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在病變黏膜中的浸潤(rùn)，從而抑制促炎因子和抗炎因子的過度分泌，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，最終鈍化適應(yīng)性免疫應(yīng)答，全面抑制炎癥性腸病發(fā)展過程中的攻擊性免疫反應(yīng)[4]。腸道在游離狀態(tài)下不受神經(jīng)支配，去神經(jīng)手術(shù)同樣使結(jié)腸不受神經(jīng)支配，由此我們推測(cè)去神經(jīng)手術(shù)可影響腸道的免疫功能。故本文使用葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)建立大鼠結(jié)腸炎模型后予行去神經(jīng)術(shù)，通過檢測(cè)結(jié)腸組織中分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18的表達(dá)水平及外周血巨噬細(xì)胞M1/M2比值，探討去神經(jīng)對(duì)結(jié)腸炎大鼠的治療作用和可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證SCXK(鄂)2019-0001，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司]，雌雄各半，150～180 g，周齡7～8周。將大鼠在濕度為50%、溫度為24 ℃左右條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑和儀器 葡聚糖硫酸鈉(上海翌圣生物科技股份有限公司，貨號(hào)：60316EA25)，HE染液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G112)，蛋白質(zhì)裂解液(武漢博士德公司，批號(hào)：SNl09)，二喹啉甲酸試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào):C0105)，兔源SIgA單克隆一抗(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab245115)，GAPDH抗體(北京同立海源生物科技有限公司，貨號(hào)：BC025840)，辣根酶標(biāo)記羊抗兔SIgA二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：GAl014)，SIgA免疫組化試劑盒[杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，貨號(hào)：(IM)-(01)-0208]，IL-1β、 IL-18 ELISA試劑盒(武漢恩菲生物科技有限公司，貨號(hào)：EH0185，EH0036)，F(xiàn)cR-block(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：ab153521)，CD86抗體(eBioscience公司，批號(hào)：20190516)，CD163抗體(eBioscience公司，批號(hào)20200819)。GS-15R型離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，BIOBASE-EL10A型酶標(biāo)儀(山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司)，CX23型生物顯微鏡(日本Olympus公司)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 分組和建模方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只大鼠分為正常組、結(jié)腸炎組、去神經(jīng)組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠均正常飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。首先構(gòu)建結(jié)腸炎大鼠模型，使用純凈水將葡聚糖硫酸鈉配制成3%的溶液，作為結(jié)腸炎組和去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠的日常飲水，其余組大鼠均正常飲用純凈水。如大鼠出現(xiàn)肉眼血便、黏液樣便、腹瀉，同時(shí)毛色變差、活動(dòng)度下降、進(jìn)食量減少、體重下降，則判定結(jié)腸炎大鼠模型建模成功。本研究中結(jié)腸炎組和去神經(jīng)+結(jié)腸炎組所有大鼠均建模成功。建模1周后，采用戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg通過腹腔注射麻醉去神經(jīng)組和去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠，麻醉成功后模擬結(jié)腸手術(shù)過程，即在保留近腸壁系膜血管弓的前提下，離斷部分結(jié)腸系膜，使其失去外源性神經(jīng)的支配。正常組、結(jié)腸炎組未給予手術(shù)干預(yù)。

1.4 收集標(biāo)本 術(shù)后14 d處死大鼠，抽取腹腔主動(dòng)脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清，置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫⒘羧〈笫蠼Y(jié)腸組織備用。

1.5 組織病理學(xué)觀察 取結(jié)腸炎組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠病變結(jié)腸組織，其他組均取相對(duì)應(yīng)的結(jié)腸組織，制成石蠟切片，行HE染色后觀察大鼠結(jié)腸組織黏膜及肌層形態(tài)變化。

1.6 結(jié)腸組織中SIgA表達(dá)情況的檢測(cè) (1)免疫組化檢測(cè)：取結(jié)腸炎組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠病變結(jié)腸組織，其他組均取相對(duì)應(yīng)的結(jié)腸組織，制成石蠟切片，采用免疫組化試劑盒檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織SIgA表達(dá)情況，其中棕色細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)選取3個(gè)視野，在×200倍視野下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。(2)Western blot檢測(cè)：取結(jié)腸炎組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠病變結(jié)腸組織，其他組均取相對(duì)應(yīng)的結(jié)腸組織，加入蛋白質(zhì)裂解液提取總蛋白，按照二喹啉甲酸試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。取煮沸變性后的蛋白質(zhì)30 μg，行SDS-PAGE后，將蛋白移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉溶液中在室溫的條件下封閉1 h，緩沖液洗膜3次后加入一抗(1 ∶1 000)，在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜，使用緩沖液清洗3遍后加入二抗(1 ∶5 000)，室溫條件下孵育1h后再次用緩沖液清洗3遍，進(jìn)行ECL發(fā)光顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，使用Quantity One軟件計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 血清炎癥指標(biāo)的檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-1β、IL-18水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 外周血巨噬細(xì)胞的檢測(cè) 取5 mL血液標(biāo)本，通過Ficoll密度梯度離心法分別獲取小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞。按照說明書操作，首先使用3 mL濃度為4%的FcR-block孵育5 min，接著依次加入5 μL濃度為20 μg/mL的CD86抗體和5 μL濃度為20 μg/mL的CD163抗體，室溫避光孵育20 min后，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后用PBS洗兩次，最后用0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，經(jīng)濾紗過濾后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞(CD86)和M2型巨噬細(xì)胞(CD163)比值，即M1/M2比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 正常組大鼠腸黏膜上皮完整，黏膜下血管正常，腺體結(jié)構(gòu)排列規(guī)則，無(wú)充血水腫，無(wú)糜爛潰瘍。結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸黏膜上皮破潰、脫落，腺體被破壞，存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管明顯擴(kuò)張充血、肉芽組織增生、潰瘍及不同程度灶性糜爛形成的現(xiàn)象，進(jìn)一步提示建模成功。去神經(jīng)組大鼠結(jié)腸組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及輕微潰瘍形成。去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象及潰瘍程度均較結(jié)腸炎組大鼠有所改善。見圖1。

圖1 4組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)變化(HE染色；上、下圖放大倍數(shù)分別為×100、×200)

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜中SIgA的表達(dá)情況 (1)免疫組化染色顯示，與正常組相比，結(jié)腸炎組、去神經(jīng)組大鼠結(jié)腸黏膜中SIgA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞均減少(均P<0.05)；與結(jié)腸炎組相比，去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸黏膜中的SIgA表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞增加(P<0.05)。見表1和圖2。(2)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，結(jié)腸炎組、去神經(jīng)組的SIgA蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；與結(jié)腸炎組相比，去神經(jīng)+結(jié)腸炎組的SIgA蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表1和圖3。

表1 4組大鼠結(jié)腸黏膜SIgA蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 4組大鼠結(jié)腸黏膜中SIgA表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(上、下圖放大倍數(shù)分別為×100、×200)

圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織SIgA表達(dá)水平的Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.3 各組大鼠血清IL-1β和IL-18水平的比較 與正常組相比， 結(jié)腸炎組、去神經(jīng)組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組的血清IL-1β和IL-18水平均增加(均P<0.05)；與結(jié)腸炎組相比，去神經(jīng)+結(jié)腸炎組的IL-1β和IL-18水平均降低(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清IL-1β與IL-18水平的比較(x±s，pg/mL)

2.4 各組大鼠外周血巨噬細(xì)胞分化情況的比較 與正常組相比， 結(jié)腸炎組、去神經(jīng)組、去神經(jīng)+結(jié)腸炎組外周血M1/M2比值均增加(均P<0.05)；與結(jié)腸炎組相比，去神經(jīng)+結(jié)腸炎組外周血M1/M2比值降低(均P<0.05)。見表3和圖4。

圖4 4組大鼠外周血中M1型和M2型巨噬細(xì)胞分化的情況

表3 4組大鼠外周血M1/M2比值的比較(x±s)

3 討 論

在生理狀態(tài)下，結(jié)腸接觸大量的抗原，為維持正常的生理功能，其免疫耐受和防御方面須保持平衡，而過強(qiáng)或減弱的免疫應(yīng)答都會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸出現(xiàn)病理狀態(tài)[5]。神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在腦-腸軸的反饋?zhàn)饔皿w系，該體系在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起到重要作用。外源性神經(jīng)和內(nèi)源性神經(jīng)共同調(diào)節(jié)結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)、免疫、分泌、吸收等各項(xiàng)生理功能。其中外源性神經(jīng)由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)組成，通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)并作用于內(nèi)源性神經(jīng)上的受體來實(shí)現(xiàn)調(diào)控，當(dāng)外源性神經(jīng)損傷時(shí)必定會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)數(shù)量和受體敏感性發(fā)生變化[6]。而失去了外源性神經(jīng)支配，結(jié)腸正常的免疫調(diào)控必定受到影響。

本研究采用3%葡聚糖硫酸鈉代飲水建立結(jié)腸炎大鼠模型，并參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]對(duì)大鼠進(jìn)行模擬結(jié)腸手術(shù)處理，利用HE染色觀察各組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示與正常組相比，結(jié)腸炎組大鼠的結(jié)腸腺體被破壞，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而與結(jié)腸炎組相比，去神經(jīng)+結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸組織可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體結(jié)構(gòu)較為規(guī)則。這提示去神經(jīng)手術(shù)能夠改善結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的病理情況，對(duì)結(jié)腸炎大鼠有治療作用。

SIgA是腸黏膜表面的主要抗體，其在阻止病原菌的入侵中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。SIgA進(jìn)入腸道后能選擇性地包被革蘭陰性菌，形成抗原-抗體復(fù)合物，阻礙細(xì)菌與上皮細(xì)胞受體結(jié)合；同時(shí)其可刺激腸道黏液分泌并加速黏液層的流動(dòng)，從而有效地阻止細(xì)菌對(duì)腸黏膜的黏附[7]。此外，SIgA對(duì)某些病毒、細(xì)菌具有抗體活性，能抑制病毒繁殖，是消化道黏膜防御系統(tǒng)的主要成分[8-9]。通過檢測(cè)SIgA的分泌表達(dá)情況及結(jié)腸組織中T淋巴細(xì)胞亞群的分化情況，可評(píng)估結(jié)腸黏膜免疫屏障功能[10]。本研究的免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，結(jié)腸炎組大鼠結(jié)腸組織的SIgA表達(dá)水平降低，而去神經(jīng)+結(jié)腸炎組結(jié)腸組織的SIgA表達(dá)水平較結(jié)腸炎組有所升高(P<0.05)。這說明結(jié)腸炎發(fā)生后腸黏膜的SIgA表達(dá)下調(diào)，而去神經(jīng)手術(shù)能夠在一定程度上提高結(jié)腸炎大鼠腸道的SIgA水平，從而發(fā)揮保護(hù)腸道黏膜的作用。

IL-1β能介導(dǎo)結(jié)腸炎早期的炎癥反應(yīng)，刺激其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，還能反饋性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌IL-2，進(jìn)而加速炎癥反應(yīng)[11]。IL-1β還可通過促進(jìn)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使趨化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腸道病變部位，引發(fā)腸道的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸組織破壞[12]。IL-18具有促進(jìn)IL-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)生，刺激腫瘤壞死因子α和多種趨化因子合成，以及誘導(dǎo)Th1產(chǎn)生Ⅰ型干擾素等多種生物學(xué)功能[13]。結(jié)腸炎的發(fā)病與免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，特別是細(xì)胞因子的異常表達(dá)，IL-18作為一種炎性反應(yīng)前細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞釋放γ-干擾素，其在結(jié)腸炎的免疫異常及炎性反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用[14]。且研究表明，IL-1β和IL-18具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可影響結(jié)腸炎的發(fā)展[15]。巨噬細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)其功能和表型主要可分為M1型及M2型。腸黏膜中存在大量巨噬細(xì)胞，其可在不同因素的刺激下分化成兩種不同的類型——經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞和替代活化巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。M1型及M2型巨噬細(xì)胞的失衡是腸道炎癥發(fā)生的關(guān)鍵[16]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸炎組大鼠血清炎癥因子IL-1β和IL-18水平、外周血巨噬細(xì)胞M1/M2比值均升高，而去神經(jīng)手術(shù)能夠有效降低結(jié)腸炎大鼠血清炎癥因子水平及外周血巨噬細(xì)胞M1/M2比值(P<0.05)。由此可見去神經(jīng)手術(shù)能夠明顯改善結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的病理情況，對(duì)大鼠的免疫功能也具有顯著的調(diào)節(jié)作用。 原因可能是結(jié)腸炎發(fā)生時(shí)，體內(nèi)炎癥因子會(huì)呈瀑布式釋放，引起結(jié)腸道損傷[17]；而外源性去除神經(jīng)可通過抑制結(jié)腸的免疫反應(yīng)來減輕這種炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮治療結(jié)腸炎的作用。機(jī)制可能是，T淋巴細(xì)胞是一個(gè)由多種相互關(guān)聯(lián)、相互制衡的亞群細(xì)胞組成的群體，結(jié)腸炎癥的實(shí)質(zhì)就是T淋巴細(xì)胞中各亞群比例失調(diào)所引起的、以自身組織為攻擊目標(biāo)的免疫反應(yīng)造成的結(jié)果。外源性去除神經(jīng)對(duì)結(jié)腸炎的治療作用可能與其直接的免疫抑制作用有關(guān)，即外源性去除神經(jīng)可通過直接阻滯Th增殖，以及減少Th各亞群(如Th1、Th2)在病變黏膜中的浸潤(rùn)，而抑制促炎因子γ-干擾素、IL-4、IL-12p70、IL-17和抗炎因子IL-10的分泌，最終全面抑制結(jié)腸炎發(fā)展過程中的攻擊性免疫反應(yīng)。

值得注意的是，本研究中，與正常組相比，去神經(jīng)組大鼠結(jié)腸組織可見少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，SIgA表達(dá)水平降低，血清炎癥因子IL-1β和IL-18水平、巨噬細(xì)胞M1/M2比值水平均升高。這說明去神經(jīng)手術(shù)可對(duì)正常結(jié)腸組織造成一定的影響，在一定程度上降低了保護(hù)性抗體SIgA的水平，并增強(qiáng)正常結(jié)腸的炎癥反應(yīng)。因此，外源性去除神經(jīng)或許可成為治療急性結(jié)腸炎的潛在手段，但需在明確診斷和適應(yīng)證后實(shí)施，以免對(duì)正常結(jié)腸組織造成傷害。

綜上所述，外源性去除神經(jīng)對(duì)結(jié)腸炎大鼠有一定的治療作用，其可能通過上調(diào)保護(hù)性SIgA的表達(dá)、抑制外周血巨噬細(xì)胞向M1型分化和炎癥因子的表達(dá)，來調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮治療作用。這或可為外源性去除神經(jīng)在臨床上的應(yīng)用，以及成為治療急性結(jié)腸炎的潛在手段，提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。