黃 婧 潘平山 蒙達(dá)華 王林琳

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院優(yōu)生遺傳門診，廣西南寧市 530003)

羊水是胎兒在母體宮內(nèi)生存所不可缺少的重要成分，主要來源于母體血清經(jīng)胎膜進(jìn)入羊膜腔的透析液、胎肺分泌液、臍帶華通氏膠及胎兒皮膚滲出液[1]。正常妊娠時(shí)羊水的產(chǎn)生與吸收處于動(dòng)態(tài)平衡，而羊水產(chǎn)生和吸收失衡將導(dǎo)致羊水量異常。羊水過多是一種常見的妊娠期并發(fā)癥，發(fā)生率為1%～3%[2]。妊娠期間羊水量超過2 000 mL即為羊水過多，超聲表現(xiàn)為最大羊水暗區(qū)垂直深度≥8 cm或羊水指數(shù)≥25 cm[3]。羊水過多對(duì)胎兒危害較大，是妊娠不良結(jié)局的重要原因之一。羊水過多的病因十分復(fù)雜，有研究表明染色體異常等遺傳病是羊水過多的重要因素之一[3]。染色體微陣列分析技術(shù)可以在基因組水平上檢測染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)，同時(shí)可檢測染色體嵌合體(嵌合比例>20%)、雜合性缺失、單親二倍體等，目前已被廣泛應(yīng)用于診斷胎兒結(jié)構(gòu)畸形、原發(fā)性智力低下、生長發(fā)育遲緩、自閉癥、多發(fā)畸形及腫瘤等遺傳學(xué)領(lǐng)域[4]。本文通過回顧性分析407例羊水過多孕婦的產(chǎn)前診斷檢測結(jié)果，探討單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism microarray，SNP-array)技術(shù)在羊水過多孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年1月至2019年 12月就診于廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院的407例妊娠中晚期羊水過多孕婦的臨床資料，孕周均≥17周，年齡20～42(30.16±3.42)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)前超聲篩查發(fā)現(xiàn)羊水過多的孕婦；接受抽取羊水或臍帶血進(jìn)行染色體核型分析及SNP-array檢測的孕婦；孕婦及家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：不能配合行羊膜腔或臍靜脈穿刺者，存在羊膜腔或臍靜脈穿刺術(shù)禁忌證者。

1.2 研究方法 所有孕婦均接受檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書。對(duì)于孕17～22周的孕婦，在B超腹部探頭引導(dǎo)下行經(jīng)腹羊膜腔穿刺并抽取羊水30 mL，對(duì)于孕周>22周的孕婦，在B超腹部探頭引導(dǎo)下行經(jīng)腹臍靜脈穿刺并抽取臍帶血1.5 mL，進(jìn)行染色體核型分析及SNP-array檢測。30 mL羊水中，20 mL用于染色體核型分析，10 mL用于SNP-array檢測；1.5 mL臍帶血中，0.5 mL用于染色體核型分析，1 mL用于SNP-array檢測。

1.2.1 染色體核型分析：對(duì)獲取的樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取20 mL羊水標(biāo)本接種至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后用10 μg/mL的秋水仙素干預(yù)3.5 h以阻斷細(xì)胞有絲分裂，當(dāng)細(xì)胞處于中期分裂相時(shí)，使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲處理、固定后，將調(diào)整為適合濃度的細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片、烤片、制片，第2天進(jìn)行G顯帶分析。取0.5 mL臍帶血標(biāo)本接種到淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)68～72 h后用40 μg/mL秋水仙素干預(yù)15 min以阻斷細(xì)胞有絲分裂，獲取中期分裂相細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲處理、固定后，將調(diào)整為適合濃度的懸液進(jìn)行滴片、烤片、制片，第2天進(jìn)行G顯帶分析。每份標(biāo)本至少計(jì)數(shù)20個(gè)分裂相，分析5個(gè)核型。若發(fā)現(xiàn)嵌合體核型則增加計(jì)數(shù)至100個(gè)分裂相。參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(2016)進(jìn)行染色體核型命名。

1.2.2 SNP-array檢測：采用Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑盒(廈門致善生物科技有限公司，批號(hào)：200116)提取臍帶血標(biāo)本中的基因組DNA；采用微量樣品基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：DP316]提取羊水標(biāo)本中的基因組DNA。采用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定DNA濃度及純度。采用美國Illumina公司的HumanCytoSNP-12芯片進(jìn)行SNP-array分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)基因組DNA依次進(jìn)行全基因組擴(kuò)增、片段化、雜交和熒光染色，采用美國Illumina公司的iScan芯片掃描儀對(duì)制備的基因芯片進(jìn)行掃描，獲得的數(shù)據(jù)采用KaryoStudio 1.4.3軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分析參照本實(shí)驗(yàn)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫及正常人基因組變異數(shù)據(jù)庫DGV(http://dgv.tcag.ca/)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk)、UCSC Genome Browser(https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu)、在線《人類孟德爾遺傳》(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://omim.org/)等公共在線數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 407例羊水過多孕婦中，染色體核型異常24例，檢出率為5.90%(24/407)，其中21-三體綜合征14例，18-三體綜合征4例，超雄綜合征1例，染色體缺失/重復(fù)5例。

2.2 SNP-array檢測結(jié)果 407例羊水過多孕婦中，SNP-array檢測檢出66例芯片異常，檢出率為16.22%(66/407)。66例芯片異常包括33例致病性CNV和33例臨床意義不明CNV。33例致病性CNV中，24例的檢測結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致，另9例染色體核型分析未見異常但SNP-array檢測檢出染色體微缺失/微重復(fù)綜合征。見表1。

表1 9例微缺失/微重復(fù)綜合征孕婦的SNP-array檢測結(jié)果

3 討 論

羊水過多時(shí)子宮張力增高，影響孕婦休息，使血壓升高、子宮血供不佳，導(dǎo)致子宮、胎盤發(fā)生缺血缺氧。羊水過多除了容易導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)，還可以引起胎盤早剝，同時(shí)，羊水過多引起的子宮肌纖維過度伸展可致子宮收縮乏力，增加產(chǎn)后出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[4]。羊水過多會(huì)干擾胎兒的生長環(huán)境，使得胎兒頻繁活動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致胎位不正及臍帶繞頸，嚴(yán)重者可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫甚至胎死腹中[5]。2018年美國母胎醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布了相關(guān)指南[6]，該指南詳細(xì)闡述了羊水過多的診斷標(biāo)準(zhǔn)、病因及圍產(chǎn)期管理措施，建議確診羊水過多后應(yīng)首先進(jìn)行病因分析，根據(jù)病因給予相應(yīng)臨床處理。Blitz等[7]的研究表明，在羊水過多合并或不合并B超其他異常的胎兒中，染色體非整倍體的發(fā)生率分別為10%和1%。另外，部分孕婦由于只存在羊水過多的單一指征，未給予足夠的重視，導(dǎo)致胎兒出生后出現(xiàn)各類代謝性綜合征、神經(jīng)肌肉病等遺傳性疾病。因此，對(duì)羊水過多的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷，對(duì)指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育、提高出生人口質(zhì)量、減少出生缺陷具有重要意義。

染色體微陣列分析技術(shù)能夠在全基因組水平上檢測染色體CNV，彌補(bǔ)常規(guī)核型分析無法檢出亞顯微異常的不足。其中，SNP-array技術(shù)是對(duì)患者DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記并雜交到芯片上，與來源于數(shù)據(jù)庫的標(biāo)準(zhǔn)人類基因組正常序列進(jìn)行比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)患者DNA拷貝數(shù)變化的一項(xiàng)技術(shù)。SNP-array技術(shù)除了能夠檢測出CNV，還能夠檢測出雜合性缺失、單親二倍體、三倍體(和其他多倍體)及一定比例的嵌合體[8]。在核型分析結(jié)果正常的遺傳咨詢者中，SNP-array技術(shù)可以額外檢測出某些致病性基因組不平衡或遺傳突變[9]。近年來研究表明，CNV也與羊水過多密切相關(guān)[10-11]。SNP-array技術(shù)已被國內(nèi)與國際細(xì)胞遺傳協(xié)會(huì)推薦為胎兒超聲異常的首選檢查方法[12-13]。本研究407例羊水過多孕婦中，染色體核型分析檢出染色體核型異常24例，檢出率為5.90%(24/407)，SNP-array檢出66例芯片異常，檢出率為16.22%(66/407)，66例芯片異常包括33例致病性CNV和33例臨床意義不明CNV；33例致病性CNV中，24例與染色體核型分析結(jié)果一致，包括14例21-三體綜合征、4例18-三體綜合征、1例超雄綜合征和5例染色體缺失/重復(fù)，其余9例為染色體核型分析未見異常但SNP-array檢出染色體微缺失/微重復(fù)綜合征。這提示SNP-array技術(shù)對(duì)非整倍體和不平衡性染色體數(shù)量重排的檢出率與傳統(tǒng)核型分析方法相近，并具有更高的分辨率。

本研究SNP-array技術(shù)額外檢出的9例致病性染色體微缺失/微重復(fù)綜合征病例中，病例1檢測到16號(hào)染色體p13.3區(qū)域存在約0.05 Mb的純合缺失，為致病性CNV，該缺失片段包含2個(gè)致病性O(shè)MIM基因：糖化血紅蛋白A1型(glycosylated hemoglobin type A1,HBA1)和糖化血紅蛋白A2型(glycosylated hemoglobin type A2,HBA2)。這兩個(gè)基因均與地中海貧血有關(guān)，雙基因純合缺失可導(dǎo)致嚴(yán)重的地中海貧血癥狀。病例2缺失片段包含黑色素瘤抗原家族D2(melanoma antigen family D2,MAGED2)基因，而MAGED2基因?qū)τ谔耗I臟再吸收鈉鹽、保持羊水平衡并維持妊娠具有重要作用，該基因突變與暫時(shí)性Bartter綜合征相關(guān)，為X連鎖隱性遺傳。有文獻(xiàn)報(bào)告，導(dǎo)致MAGED2基因功能喪失的突變可引起羊水過多及早產(chǎn)，還可引起嚴(yán)重但暫時(shí)的產(chǎn)前Bartter綜合征[14]。病例3中1q21.1區(qū)域片段重復(fù)部分與1q21.1重復(fù)綜合征有關(guān)，包含關(guān)鍵基因AMP活化型蛋白激酶β2(非催化亞型)(protein kinase,AMP-activated,beta 2 non-catalytic subunit,PRKAB2)和縫隙連接蛋白α-5(gap junction protein alpha-5,GJA5)，1q21.1重復(fù)區(qū)域外顯率不全，表現(xiàn)度可變，患者具有廣泛的臨床表現(xiàn)，包括發(fā)育遲緩、心臟畸形、輕度特殊面容等，但部分患者亦可無明顯臨床表現(xiàn)。研究表明，1q21.1區(qū)域的重復(fù)與先天性心臟病相關(guān)，其中GJA5基因的CNV與心臟發(fā)育異常相關(guān)[15]。病例4檢出的16p13.3區(qū)域缺失片段包含HBA1和HBA2基因，與地中海貧血有關(guān)；此外，該病例中Yq11.222q11.223缺失區(qū)域涉及Y染色體無精子因子b(azoospermia factor b ,AZFb)區(qū)域，AZFb區(qū)域整段缺失的患者可存在唯支持細(xì)胞綜合征或生精阻滯的典型睪丸組織學(xué)特征，其臨床表現(xiàn)主要為少弱精子癥[16]。研究顯示，AZFb區(qū)域部分缺失的男性能夠自然生育帶有同樣Y染色體缺失的后代[17]，因此筆者建議對(duì)此類患者進(jìn)一步行胎兒產(chǎn)前α地中海貧血基因檢測、Y染色體缺失檢測及父親Y染色體驗(yàn)證。病例5檢出3號(hào)染色體短臂缺失，這可導(dǎo)致3pter-p25缺失綜合征，該病的常見臨床表現(xiàn)為宮內(nèi)發(fā)育遲緩、低出生體重、小頭畸形、三角頭、肌張力低下、精神發(fā)育遲緩、上瞼下垂、內(nèi)眥、小頜畸形等。病例6與病例9均檢測到22q11.21區(qū)域存在片段缺失，表現(xiàn)為DiGeorge綜合征，該病缺失的關(guān)鍵基因?yàn)門-box轉(zhuǎn)錄因子1(T-box transcription factor 1,TBX1)，臨床表現(xiàn)為胸腺發(fā)育不全、低血鈣癥、心臟(心血管)畸形、骨骼畸形、特殊面容、身材矮小、學(xué)習(xí)困難[18]。病例7檢出2q13缺失基因組疾病，該病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、小頭畸形、智力障礙及先天畸形相關(guān)癥狀等[19-20]。病例8檢出2q37.2 q37.3區(qū)域片段重復(fù)，其臨床表現(xiàn)包括發(fā)育遲緩、伴或不伴顯著的發(fā)育及形態(tài)學(xué)異常、肌張力低下等。

另外，本研究臨床意義不明CNV的病例檢出率為8.11%(33/407)，這類病例的結(jié)果解讀與遺傳咨詢需結(jié)合孕婦及其丈夫的CNV檢測結(jié)果，一般而言，若CNV為遺傳性的，則臨床意義較小，若為新發(fā)的，則臨床意義較大，但仍需要考慮不完全外顯和臨床表型差異的影響。對(duì)于雜合性缺失是否需要報(bào)告，應(yīng)以雜合性缺失區(qū)域內(nèi)是否涉及嚴(yán)重的隱性遺傳病基因?yàn)閰⒖家罁?jù)，如果涉及隱性遺傳病相關(guān)基因，可在報(bào)告中建議行外顯子測序以排除純合致病基因突變的可能。

綜上所述，對(duì)于中晚期羊水過多孕婦，在常規(guī)染色體核型分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行SNP-array檢測可獲得更多的遺傳學(xué)信息，有助于發(fā)現(xiàn)染色體核型分析無法檢出的染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常，以及提高對(duì)羊水過多胎兒的遺傳學(xué)病因診斷率，從而為羊水過多孕婦的胎兒預(yù)后評(píng)估及遺傳咨詢提供更優(yōu)的臨床決策。