劉亞林，葉林江，寇一翾，范鄧妹，張志勇，程珊梅*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.景德鎮(zhèn)學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，江西 景德鎮(zhèn) 333400）

【研究意義】青錢柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.]隸屬于胡桃科青岡屬（Cyclocarya），是中國(guó)特有的單種屬植物[1]，廣泛分布于江西、浙江、江蘇等省[2]。青錢柳為風(fēng)媒傳粉，樹(shù)干通直；果具圓形翅，形似串串銅錢，有很高的庭院觀賞價(jià)值；其葉味甘，具有顯著的降血糖功效[3]。它是一種集藥用、保健、用材和觀賞等價(jià)值于一身的多用途樹(shù)種，在國(guó)內(nèi)多地被推廣種植[4-5]。青錢柳具有與地理環(huán)境密切相關(guān)的遺傳多樣性和遺傳分化[6-7]，同時(shí)江西省被認(rèn)為是青錢柳的冰期避難所之一[8]，江西省青錢柳自然居群分布廣泛，有較高的遺傳多樣性。江西省三面環(huán)山，北部的鄱陽(yáng)湖盆地，中部的丘陵低山和平原，使其整體呈現(xiàn)出一個(gè)開(kāi)口朝北的“簸箕”狀，地理位置較為獨(dú)立，是一個(gè)研究小尺度基因流的理想生態(tài)單元?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)對(duì)青錢柳遺傳背景的研究較少，且主要集中在探究其大尺度范圍遺傳分化、不同種源的遺傳多樣性和遺傳馴化方面。周一旸等[9]利用SRAP 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)青錢柳各種源種群間變異大，同時(shí)種源內(nèi)也高度分化。Kou 等[8]綜合葉綠體和核基因兩種遺傳標(biāo)記，得出青錢柳有很長(zhǎng)的進(jìn)化歷史，具有武夷山脈和云貴高原東側(cè)兩個(gè)冰期避難所。陳秀娟等[10]利用ISSR 分子標(biāo)記，對(duì)青錢柳種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)青錢柳種質(zhì)在長(zhǎng)期的適應(yīng)和進(jìn)化過(guò)程中形成了廣泛的遺傳變異，個(gè)體間遺傳差異大。Li等[11]利用ISSR 和SSR 分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)青錢柳群體間遺傳分化較低，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)。

【本研究切入點(diǎn)】綜合前人研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳有高度的種內(nèi)分化，這與地理環(huán)境密切相關(guān)。但前人研究主要是在全國(guó)范圍探討其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并未關(guān)注到獨(dú)特的小區(qū)域中的遺傳分化，尤其是小尺度的基因流。而江西省周圍山脈是與鄰省的自然地理界線，能夠隔絕大量外界基因流的干擾，是研究這些問(wèn)題的一個(gè)理想的獨(dú)立生態(tài)單元。分子標(biāo)記受生理?xiàng)l件和環(huán)境因素的影響較小，近年來(lái)開(kāi)發(fā)出許多評(píng)估遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的分子標(biāo)記，如RFLP、AFLP、ISSR 和SSR 等標(biāo)記[12]。SSR 標(biāo)記具有共顯性、效率高、可重復(fù)等突出優(yōu)點(diǎn)，是鑒定種源多樣性的理想分子標(biāo)記[13]。Fan 等[14]為青錢柳開(kāi)發(fā)了28 對(duì)SSR 引物，本研究以此為基礎(chǔ)開(kāi)展試驗(yàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探究江西省青錢柳居群的遺傳分化和基因流方向，能夠獲得大量有關(guān)青錢柳居群遺傳多樣性和自然演替的信息。由此能夠闡明獨(dú)立生態(tài)單元中青錢柳的基因流和遺傳分化趨勢(shì)，地理環(huán)境和氣候變化對(duì)種群內(nèi)和種群間多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的影響[15]，進(jìn)而選出適應(yīng)江西省氣候的廣適性青錢柳種源，為其今后的育種和藥用提供資源支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和總DNA提取

研究樣品采集于江西省境內(nèi)26個(gè)青錢柳的自然居群（表1），共283份樣品。每個(gè)居群均在1 km×1 km的范圍內(nèi)采集，每棵植株均采取健康幼嫩葉片并立即用硅膠干燥，同時(shí)記錄詳細(xì)采集信息，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 江西省青錢柳自然居群樣品信息[17]Tab.1 The sample information of Cyclocarya paliurus in Jiangxi Province

采用改良CTAB 方法，從已經(jīng)被硅膠干燥的葉片組織中提取總DNA[16]。在10 g/L 瓊脂糖凝膠中，通過(guò)與已知標(biāo)準(zhǔn)lambda DNA 進(jìn)行比較來(lái)評(píng)估分離DNA 的濃度。然后，將分離的基因組DNA 稀釋并保存在4 ℃下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2 微衛(wèi)星引物和PCR擴(kuò)增

挑選來(lái)自不同居群的24份DNA樣品，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，從已開(kāi)發(fā)的青錢柳微衛(wèi)星引物中篩選出8 對(duì)清晰的多態(tài)引物（表2）。利用篩選出來(lái)的8 對(duì)引物對(duì)青錢柳26 個(gè)居群的283 個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR。在每個(gè)正向引物序列的5'端附加一個(gè)M13（5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3'）引物，用熒光標(biāo)簽標(biāo)記（FAM/TAM，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）。PCR 產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管電泳分離，使用ABI 3730 XL自動(dòng)測(cè)序儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），以LIZ-500為內(nèi)標(biāo)。使用Gene Mapper v.4.0軟件（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）分析色譜圖。后續(xù)分析時(shí)為了避免誤差，將刪除樣品數(shù)少于3的居群。

表2 青錢柳8對(duì)微衛(wèi)星引物[14]Tab.2 Characteristics of eight microsatellite primers in the Cyclocarya paliurus

1.3 數(shù)據(jù)分析

GeneMarker v2.2.0 軟件[18]根據(jù)每個(gè)熒光標(biāo)記、序列長(zhǎng)度定義等位基因，讀取并記錄每個(gè)等位基因的大小。利用GENEPOP v.3.4 軟件[19]進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡和連鎖不平衡（LD）檢測(cè)，并對(duì)其顯著性水平進(jìn)行Bonferroni 校正[20]。使用GenAlEx v6.5[21]計(jì)算了各位點(diǎn)的Shannon 多樣性指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和基因流（Nm），以及居群平均等位基因數(shù)（NA）和有效等位基因數(shù)（NE）。用Cervus v3.0.7 計(jì)算各位點(diǎn)多態(tài)信息含量（PIC）[22]。Arlequin v3.11 軟件[23]進(jìn)行F-統(tǒng)計(jì)[24]以計(jì)算各居群近交系數(shù)（FIS）、遺傳分化系數(shù)（FST）值。

STRUCTURE 2.3.4 軟件[25]分析試驗(yàn)材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)，使用100 000 個(gè)循環(huán)，10 000 個(gè)MCMC 重復(fù)，應(yīng)用混合祖先模型，K值范圍為1到10，每個(gè)值迭代10次。利用網(wǎng)站程序structure Harvester，根據(jù)ΔK值確定最佳種群結(jié)構(gòu)和亞群數(shù)（http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）。通過(guò)POPGENE v1.32軟件[26]，基于Nei’距離構(gòu)建UPGMA樹(shù)。基于STRUCTURE和UPGMA樹(shù)分組結(jié)果，對(duì)所有進(jìn)行分組，使用GenAlEx v6.5進(jìn)行主成分分析（PCoA）。

為了比較現(xiàn)代和歷史時(shí)期的遷移率，使用了BAYESASS 3.4.0[27]和Migrate v3.6.8[28]軟件。這兩個(gè)程序都會(huì)生成參數(shù)，從中可以推斷出基因流遷移率的可比測(cè)量值（m：每代由遺傳移民組成的人口比例）。但每一個(gè)程序都會(huì)在不同的時(shí)間尺度上估計(jì)該參數(shù)：BAYESASS 使用貝葉斯方法和MCMC 抽樣來(lái)生成m值，Migrate通過(guò)貝葉斯法推測(cè)突變比例遷移率（m）。Migrate v3.6.8使用合并法來(lái)估計(jì)成對(duì)種群之間的相對(duì)有效種群大小（θ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

對(duì)江西青錢柳的居群-位點(diǎn)組合（176個(gè)）進(jìn)行哈迪溫伯格平衡（HWE）檢測(cè)，以及在各自的居群水平對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)（28個(gè)位點(diǎn)對(duì)）進(jìn)行連鎖不平衡（LD）分析。結(jié)果經(jīng)校正后[20]，13個(gè)居群-位點(diǎn)組合偏離HWE平衡（P＜0.05），1個(gè)位點(diǎn)對(duì)存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

8 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在江西省青錢柳自然居群277 個(gè)個(gè)體中共檢測(cè)到81 個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為7～15 個(gè)，平均為10.125；平均觀測(cè)雜合度（HO）為0.610；平均期望雜合度（HE）為0.597；平均Shannon 多樣性指數(shù)（I）為1.178；平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.664（表3）。

表3 青錢柳在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab.3 Summary of genetic statistics and gene flow of eight loci in the Cyclocarya paliurus

各居群的平均等位基因數(shù)（NA）從2.375（居群GX）至6.500（居群LC），平均值為4.875。觀測(cè)雜合度（HO）和期望雜合度（HE）居群間差異不大，變化范圍分別為0.467（居群XS）～0.750（居群JA）和0.441（居群GX）～0.664（居群YH 和LC），見(jiàn)表4。以上數(shù)據(jù)表明，江西省青錢柳自然居群遺傳多樣性水平中等偏高，各居群遺傳多樣性差異不大。

表4 青錢柳22個(gè)居群在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of Cyclocarya paliurus from 22 populations using eight SSR primers

2.2 江西省青錢柳自然居群遺傳結(jié)構(gòu)

各居群的遺傳分化系數(shù)（FST）差異很小，變化范圍是0.093～0.102，平均值為0.097（表4）。根據(jù)對(duì)種群分化系數(shù)的劃分[17]，江西省青錢柳自然居群間為中度分化。江西省青錢柳居群內(nèi)近交系數(shù)（FIS）除居群XS（0.207）和JX（0.110）為顯著，居群SQS（0.163）為極顯著和居群LC（0.184）為極其顯著，其他居群近交不顯著，平均近交系數(shù)為0.029（表4）。

對(duì)江西省青錢柳的22 個(gè)自然居群進(jìn)行Structure 聚類分析，根據(jù)ΔK的評(píng)判結(jié)果，確認(rèn)K=3 為最佳分組數(shù)（圖1）。雖然江西省境內(nèi)的青錢柳居群的遺傳組分為3組，但它們?cè)诖蟛糠志尤洪g存在基因滲入現(xiàn)象，組分間未完全分開(kāi)。不同組分在地理分布上有一定的規(guī)律，紅色類型的遺傳組分較多分布在江西的西北部，黃色的遺傳組分主要分布在江西中部，而綠色的遺傳組分主要分布在江西的東南部（圖1a）。Nei’距離的UPGMA 樹(shù)聚類結(jié)果與青錢柳居群的地理分布位置有一定關(guān)系（圖2a），與Structure 聚類結(jié)果也有一定相似。

圖1 基于8對(duì)微衛(wèi)星引物的江西青錢柳自然居群Structure分析Fig.1 Natural population structure analysis of C.paliurus in Jiangxi Province based on 8 pairs of microsatellite primers

基于Structure 和UPGMA 樹(shù)聚類分析結(jié)果（圖1，圖2a），將22 個(gè)居群分為3 組，分別為居群內(nèi)主要為紅色遺傳組分的為N1（包括9個(gè)群體，分別為FX、TG、WYs、XS、FY、CY、SQS、LS、YF）、主要為黃色遺傳組分的為N2（包括7 個(gè)群體，分別為GuiX、HJ、JA、SC、AF、JX、SY）、主要為綠色遺傳組分的為N3（包括6 個(gè)群體，分別為YH、GX、WYd、LC、JGS、GF）。將這3組進(jìn)行主成分分析（PCoA），它們?cè)谧鴺?biāo)上有聚類傾向（圖2b），與Structure不同遺傳組分的分組和分布格局相符合。

圖2 基于8對(duì)微衛(wèi)星引物遺傳距離數(shù)據(jù)構(gòu)建的江西青錢柳自然居群聚類分析Fig.2 Cluster analysis of natural populations of C.paliurus in Jiangxi Province based on genetic distance data of 8 pairs of microsatellite primers

2.3 居群間基因流

江西青錢柳自然居群之間的基因流，除位點(diǎn)CYC055（0.980）外，其他位點(diǎn)檢測(cè)出的基因流（Nm）都大于1，并且平均基因流為1.733（表3），說(shuō)明居群間的現(xiàn)代基因流較大，每代有一個(gè)以上的移民。同時(shí)，通過(guò)Migrate 軟件估算，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)組之間的歷史基因流遷移率和現(xiàn)代基因流遷移率都較大，變化范圍分別為0.002 7～0.020 5和0.004 5～0.062 8（圖3）。

現(xiàn)代基因流遷移率與歷史基因流遷移率相比較大，且3 個(gè)組分之間存在不對(duì)稱的雙向基因流（圖3）。N1 組的現(xiàn)代基因流遷移率向其他兩組遷出量遠(yuǎn)比遷入量小得多。而N2 組的歷史基因流遷移率由其他兩組向N2 組遷入較強(qiáng)，現(xiàn)代基因流遷移率向其他兩組遷出較強(qiáng)。N3組的歷史基因流遷移率向其他兩組遷出較強(qiáng)，但現(xiàn)代基因流遷移率中兩兩組分之間N2 向N3 遷入較強(qiáng)，N3 向N1 遷入較強(qiáng)。N1、N2 和N3 組的有效種群大?。é龋┓謩e為1.32、1.68 和2.07（圖3）。

圖3 江西青錢柳3個(gè)組之間的歷史基因流遷移率（紅色箭頭）和現(xiàn)代基因流遷移率（黑色箭頭）Fig.3 Historical gene flow mobility（red arrow）and modern gene flow mobility（black arrow）between the three groups of C.paliurus in Jiangxi Province

以上數(shù)據(jù)表明，江西省青錢柳歷史和現(xiàn)代基因交流頻繁，并且現(xiàn)代更顯著。從歷史和現(xiàn)代的基因流可以看出，N1 組種群在歷史上是擴(kuò)張的，而在現(xiàn)代是收縮的；N2 組居群在歷史上是收縮的，現(xiàn)代是擴(kuò)張的；N3組居群雖然有效種群最大，但它受到N2組較強(qiáng)的基因滲入，進(jìn)而開(kāi)始滲入N1組。

3 結(jié)論與討論

3.1 整體上較高水平的遺傳多樣性

基于SSR 分子標(biāo)記，本研究在江西省青錢柳自然群體中檢測(cè)到高水平的多態(tài)性（HE=0.597、I=1.178）（表3），與李曉春等[11]利用SSR 標(biāo)記得出的青錢柳遺傳多樣性（HE=0.404、I=0.626）相比較高，其原因與研究采用的標(biāo)記數(shù)量、采樣范圍和材料個(gè)體數(shù)量有關(guān)。但陳秀娟等[10]利用ISSR 和周一旸等[9]利用SRAP 標(biāo)記都得出了青錢柳種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性的結(jié)論，與本研究結(jié)果相符。青錢柳的異二歧開(kāi)花習(xí)性（青錢柳的自然群體中有兩種交配類型）[29]，可能是導(dǎo)致自然居群遺傳多樣性水平較高的原因之一。整體上江西青錢柳自然居群間遺傳多樣性水平差異不大，但居群GX 遺傳多樣性相比較?。℉E=0.441）（表4），推測(cè)這與GX居群采樣數(shù)較少有關(guān)。

3.2 江西省青錢柳自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

平均Nm 大于1，大部分居群近交不明顯，原因可能是青錢柳花粉和種子的傳播能力較強(qiáng)，并且江西省中部較多的盆地和平原為不同居群的基因交流提供了條件。但少數(shù)存在輕微的近交，如居群LC、SQS和XS，推測(cè)可能由于野生青錢柳多處于深山或保護(hù)區(qū)內(nèi)，居群被郁閉的森林環(huán)境和山脈遮擋，導(dǎo)致花粉和種子傳播受到影響。

Structure、UPGMA 樹(shù)和主成分分析（PCoA）聚類分析結(jié)果表明江西省青錢柳自然居群的遺傳組分為3 組，N1、N2 和N3，有一定的地理分布規(guī)律，大部分居群間存在基因滲入。Migrate 軟件分析得出現(xiàn)代基因流遷移率與歷史基因流遷移率相比較大，且3個(gè)組分之間存在不對(duì)稱的雙向基因流。并且從歷史和現(xiàn)代的基因流遷移率可以看出，N1組種群在歷史上是擴(kuò)張的，而在現(xiàn)代是收縮的；N2組居群在歷史上是收縮的，現(xiàn)代是擴(kuò)張的；N3 組居群雖然有效種群最大，但它受到N2 組較強(qiáng)的基因滲入，進(jìn)而開(kāi)始滲入N1組。結(jié)合江西省內(nèi)青錢柳居群的遺傳結(jié)構(gòu)和基因流結(jié)果，筆者推測(cè)江西省青錢柳自然居群存在中部和南部種群向北部基因滲入遷移的趨勢(shì)，同時(shí)中部種群利用地理優(yōu)勢(shì)迅速向四周擴(kuò)散。

江西省青錢柳自然居群遺傳組分為3 組，歷史和現(xiàn)代基因流共同作用，導(dǎo)致形成當(dāng)代較高水平的遺傳多樣性。江西省中部主要為盆地和平原，為居群間的基因交流減少了阻礙，導(dǎo)致居群間分化不明顯，遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，但也使得該物種在這個(gè)獨(dú)特的生態(tài)單元中表現(xiàn)出高水平的遺傳多樣性（尤其是西北部）。或許從環(huán)境適應(yīng)性的角度來(lái)看，江西省南部居群具有優(yōu)勢(shì)，然而中部居群憑借基因流向四周迅速擴(kuò)散的成效已經(jīng)十分明顯。

3.3 江西省青錢柳種質(zhì)資源的保護(hù)與開(kāi)發(fā)

大量研究發(fā)現(xiàn)青錢柳藥用價(jià)值與種源密切相關(guān)[7]，保護(hù)自然種質(zhì)資源有利于其藥用價(jià)值的進(jìn)一步研究。近年來(lái)基于青錢柳資源利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，使得培育的人工林范圍不斷擴(kuò)大，該樹(shù)種擺脫了瀕危的處境。但青錢柳自然居群是物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)，是其種質(zhì)資源的源頭。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)該樹(shù)種多以單株形式分布，大部分群體內(nèi)個(gè)體數(shù)較少，種質(zhì)資源的保護(hù)開(kāi)發(fā)迫在眉睫。并且由于其木材價(jià)值較高，近年來(lái)自然群體中成年大樹(shù)遭受了嚴(yán)重的砍伐，導(dǎo)致部分居群內(nèi)個(gè)體數(shù)量減少。同時(shí)青錢柳是一個(gè)喜陽(yáng)樹(shù)種，但部分個(gè)體分布在郁閉的深林，嚴(yán)重制約了該物種的自然更新。

根據(jù)該物種在江西省的遺傳背景，結(jié)合其面臨的嚴(yán)峻形勢(shì)，提出了以下科學(xué)保護(hù)建議。青錢柳江西省各居群具有較多遺傳分化，對(duì)大部分種群實(shí)施就地保護(hù)可以使其維持進(jìn)化潛力[6,30]。同時(shí)對(duì)不同人群，尤其是青少年，普及珍稀動(dòng)植物保護(hù)知識(shí)的工作可有效保護(hù)現(xiàn)存居群個(gè)體。針對(duì)深林和單個(gè)形式分布的個(gè)體，可以采取開(kāi)辟林窗和人工傳粉等方法解決該物種自然更新困難的問(wèn)題，擴(kuò)大種群個(gè)體數(shù)量[31]。而對(duì)于開(kāi)發(fā)種質(zhì)資源，可選取遺傳多樣性水平高的種群材料，如居群YH 和LC；東南部居群（尤其是居群GF）在環(huán)境適應(yīng)性上具有優(yōu)勢(shì)，可開(kāi)發(fā)為廣適性種源。

致謝：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目（GJJ170248）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！