張愛萍， 趙得雄， 霍春霞， 謝 玲

(青海紅十字醫(yī)院， 青海 西寧 810000)

子癇前期(Preeclampsia,PE)是妊娠中晚期特有的并發(fā)癥之一，是一種嚴(yán)重的妊娠期特異性多器官功能障礙疾病，病因復(fù)雜且治療困難，嚴(yán)重威脅孕產(chǎn)婦與胎嬰的生命安全，是臨床上導(dǎo)致圍產(chǎn)期孕婦及嬰兒死亡的重要原因[1]。PE的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多以高血壓、蛋白尿、多器官功能障礙等為病理表現(xiàn)，腎是其損傷的主要靶器官之一[2]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路參與機(jī)體多種重要的細(xì)胞生長(zhǎng)過程以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化，目前臨床上將PI3K/AKT信號(hào)通路作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[3]。在PE早期病因研究中發(fā)現(xiàn)，PE發(fā)生時(shí)出現(xiàn)胎盤淺著床、組織缺氧以及子宮螺旋動(dòng)脈重鑄異常，導(dǎo)致胎兒血氧供給不足等病理現(xiàn)象[4]，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，與腫瘤中許多細(xì)胞組織的病理變化極為相似，因此，PI3K/AKT信號(hào)通路也參與PE的發(fā)生與發(fā)展，可能作為其治療的分子靶點(diǎn)[5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的表達(dá)參與細(xì)胞分裂增殖，促進(jìn)血管生成，其過表達(dá)可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，參與調(diào)控多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[6]。越來越多的研究證實(shí)多種microRNA(miRNA)都能夠參與PE組織損傷的發(fā)生發(fā)展[7,8]。有研究表明[9]，miR-21-3p是急性腎損傷發(fā)病的重要調(diào)控因子，參與膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(SAKI)的發(fā)生發(fā)展，可以作為急性腎損傷的診斷及預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，但miR-21-3p在PE腎損傷中的機(jī)制尚未明確。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21-3p與VEGFA的靶向關(guān)系，并建立PE大鼠模型探究miR-21-3p通過靶向VEGFA調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)PE大鼠腎損傷的影響，為PE腎損傷的診療與預(yù)后提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠30只與雌性SD大鼠60只，6周齡，雄性體質(zhì)量180-200g，雌性體質(zhì)量160-180g。均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所，生產(chǎn)許可SYXK(京)2018-0042。雌雄大鼠2∶1合籠過夜，次日凌晨雌性大鼠發(fā)現(xiàn)有陰道栓即為受孕成功。將受孕大鼠飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、濕度(45±5)%，晝夜時(shí)長(zhǎng)1∶1的環(huán)境下適應(yīng)一周，期間自由飲水和采食。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品:亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-nitro arginine methyl ester，L-NAME)試劑(美侖生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(Sigma公司)；攜帶miR-21-3p基因的腺病毒載體、攜帶抑制miR-21-3p基因表達(dá)的腺病毒載體及其對(duì)照miRNA-NC空質(zhì)粒腺病毒載體(武漢博歐特生物科技有限公司)；尿蛋白、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)ELISA試劑盒(江西江藍(lán)純生物試劑有限公司)；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、蛋白提取試劑盒、蘇木精-伊紅染色試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人VEGFA、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(北京索萊寶科技有限公司)；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器:光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)；ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(北京希凱恩生物科技有限公司)；凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司)等。

1.4方 法

1.4.1腺病毒載體構(gòu)建、建模與分組:從miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中查找大鼠miR-21-3p基因序列，然后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)并合成一段含有與miR-21-3p完全互補(bǔ)的8個(gè)重復(fù)片段，再設(shè)計(jì)一段與miR-21-3p序列完全不同的miRNA序列。將PCR擴(kuò)增的帶有酶切位點(diǎn)的上述3段序列克隆至PUC19載體，然后將其與pAdTrack-CMV載體同時(shí)雙酶切，接著用T4 DNA連接酶4℃連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，即可得到3種重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)抗性篩選和酶切鑒定后進(jìn)行線性化，然后轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞，即可得到攜帶miR-21-3p基因腺病毒載體、攜帶抑制miR-21-3p基因表達(dá)腺病毒載體和miRNA-NC空質(zhì)粒腺病毒載體。接著對(duì)轉(zhuǎn)染后的293A細(xì)胞進(jìn)行多輪擴(kuò)增，來提高病毒滴度。60只SD孕鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、mimics NC組、miR-21-3p mimics組、miR-21-3p inhibitor組，每組12只。除正常組外，其余四組建立大鼠PE模型：妊娠第10d，按300mg/kg的劑量腹腔注射L-NAME溶液，每天1次，共給藥5d，并通過測(cè)血壓、24h尿蛋白，以血壓≥18kPa、尿蛋白定量≥4.0mg確認(rèn)PE大鼠造模成功[12]。造模成功后，mimics NC組尾靜脈注射miRNA-NC空質(zhì)粒腺病毒載體；miR-21-3p mimics組尾靜脈注射攜帶miR-21-3p基因腺病毒載體；miR-21-3p inhibitor組尾靜脈注射攜帶抑制miR-21-3p基因表達(dá)腺病毒載體，各1mL，每日1次，連續(xù)7 d。

1.4.2各組大鼠腎指數(shù)的計(jì)算與腎功能指標(biāo)檢測(cè):實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集各組大鼠尿液，稱取大鼠體質(zhì)量，將大鼠麻醉后動(dòng)脈取血，制備血清，保存在-80℃冰箱中備用。待血液樣本采集結(jié)束，處死各組大鼠，快速分離腎臟，去除周圍組織，稱重計(jì)算腎指數(shù)：腎指數(shù)(mg/g)=腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。之后將部分腎組織用0.9%的生理鹽水進(jìn)行漂洗、用濾紙吸干表面水分，放入4%多聚甲醛中固定；部分腎組織保存在-80℃冰箱中。取制備好的血清，按照試劑盒說明書操作測(cè)定各組大鼠血清中SCr、BUN含量；取尿液，檢測(cè)尿蛋白含量。

1.4.3各組大鼠腎組織病理變化檢測(cè):將放入4%多聚甲醛中的腎組織固定48h后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片。之后將切片依次放入二甲苯20min、梯度乙醇各5min。蘇木精-伊紅染色后中性樹脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎組織形態(tài)及病理變化。

1.4.4各組大鼠血清中IL-6、TNF-α的檢測(cè):取1.4.2中制備好的血清，運(yùn)用試劑盒測(cè)定各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

1.4.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-21-3p與VEGFA的靶向關(guān)系:采用生物信息學(xué)軟件Target Scan7.1數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-21-3p的靶基因，檢測(cè)到VEGFA的3’端含有miR-21-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示VEGFA可能是miR-21-3p的直接靶基因。將VEGFA野生型和突變型質(zhì)粒分別與miR-21-3p mimics(miR-21-3p mimics組)、miR-NC(miR-NC組)轉(zhuǎn)染至腎小管上皮細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集并裂解細(xì)胞，嚴(yán)格根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，采用螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示目的基因熒光素酶相對(duì)活性。

1.4.6各組大鼠腎組織中miR-21-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè):取2.2中保存在-80℃冰箱中的腎組織，機(jī)械勻漿后取上清液，運(yùn)用Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA，根據(jù)目的RNA種類不同使用不同試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用RT-PCR法檢測(cè)各組miR-21-3p和VEGFA基因的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參基因，按照2-△△Ct法計(jì)算miR-21-3p、VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.7各組大鼠腎組織中VEGFA、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):取1.4.2中保存在-80℃冰箱中的腎組織，加入RIPA裂解液提取總蛋白，加入BCA測(cè)定蛋白濃度，電泳轉(zhuǎn)膜后將目的條帶用5%脫脂牛奶封閉1h，清洗后加入VEGFA(1∶1000)、PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶1000)一抗孵育過夜，再次清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)孵育1h，清洗后按照ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行顯色操作，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，進(jìn)行灰度值分析，GAPDH為內(nèi)參蛋白，以所得目的條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算各組VEGFA、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎組織病理結(jié)構(gòu)變化:如圖1所示，正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞排列規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)病變，無水腫變性現(xiàn)象。模型組與mimics NC組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)被破壞，腎小管上皮細(xì)胞水腫變性，腎小球體積增大，腎小囊間隙明顯縮小，炎細(xì)胞大量浸潤(rùn)。與陰性對(duì)照組相比，miR-21-3p mimics組大鼠腎組織損傷明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，腫脹減輕；miR-21-3p inhibitor組腎組織損傷明顯加重，視野明顯可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球體積明顯變大，損傷嚴(yán)重。

圖1 各組大鼠腎組織病理結(jié)構(gòu)變化(HE,×100)

2.2各組大鼠腎指數(shù)與腎功能指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，模型組大鼠腎指數(shù)以及SCr、BUN、尿蛋白含量均顯著升高(P<0.05)。mimics NC組腎指數(shù)、SCr、BUN、尿蛋白含量與模型組比較(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-21-3p mimics組腎指數(shù)、SCr、BUN、尿蛋白含量均明顯降低(P<0.05)；miR-21-3p inhibitor組上述指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎指數(shù)與SCr BUN 尿蛋白含量的比較

2.3各組大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α的檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)。模型組與mimics NC組血清中IL-6、TNF-α水平變化無顯著差異(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-21-3p mimics組大鼠血清中血清中IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)；miR-21-3p inhibitor組大鼠血清中上述炎性因子水平均明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-6 TNF-α水平的比較

2.4miR-21-3p與VEGFA的靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果:生物信息學(xué)分析網(wǎng)站www.targetscan.org分析結(jié)果顯示，miR-21-3p與VEGFA基因3’端存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGFA野生型質(zhì)粒的miR-21-3p mimics組細(xì)胞熒光素酶活性較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

圖2 miR-21-3p和VEGFA的結(jié)合位點(diǎn)

2.5各組大鼠腎組織中miR-21-3p、VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果:與正常組相比，模型組大鼠腎組織中miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量明顯降低，VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。mimics NC組大鼠腎組織中各mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組相比無顯著差異(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-21-3p mimics組腎組織中miR-21-3p相對(duì)表達(dá)量明顯升高，VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；miR-21-3p inhibitor組腎組織miR-21-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，VEGFA mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織中miR-21-3p VEGFA mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

2.6各組大鼠腎組織中VEGFA、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，模型組腎組織中VEGFA、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，mimics NC組上述指標(biāo)變化無顯著差異(P>0.05)。與mimics NC組比較，miR-21-3p mimics組腎組織VEGFA、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；miR-21-3p inhibitor組腎組織VEGFA、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖3、表6。

表6 各組大鼠腎組織中VEGFA p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平的比較

圖3 各組大鼠腎組織VEGFA、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平

3 討 論

PE發(fā)病率極高，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主要病理表現(xiàn)為血壓、尿蛋白升高以及腎功能受損等[10]。PE腎損傷發(fā)生較早，研究發(fā)現(xiàn)，PE發(fā)生腎損傷的主要病理變化為腎小球擴(kuò)張、尿蛋白含量升高，大量性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及血清肌酐以及尿素氮含量增加[11]，因此，本研究采用HE染色法觀察腎組織病理變化結(jié)果顯示，模型大鼠腎組織發(fā)生嚴(yán)重組織病變，腎小管上皮細(xì)胞水腫變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，另外采用ELISA法檢測(cè)血清中SCr、BUN以及尿液中尿蛋白含量，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)顯著增加，提示模型大鼠腎功能受損。

PI3K是在細(xì)胞內(nèi)參與增殖、分化、凋亡以及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。研究表明，AKT是PI3K下游分子，PI3K/AKT信號(hào)通路與如糖尿病等多種人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)[12]，是經(jīng)典炎癥反應(yīng)調(diào)控通路。有研究表明PE患者體內(nèi)胎盤血流灌注不足，加上炎性因子以及活性氧的堆積，誘導(dǎo)TXA2生成，同時(shí)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，參與介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)PE大鼠模型，利用Western Blot法檢測(cè)到PE大鼠腎組織中該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)均明顯升高，炎性因子IL-6、TNF-α的含量也相對(duì)升高，說明PI3K/AKT信號(hào)通路激活誘導(dǎo)PE大鼠釋放炎性因子，進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷的發(fā)生。

VEGFA是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種二聚糖蛋白，參與機(jī)體血管生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生與凋亡[14]。miR-21-3p是SAKI的治療與預(yù)后中，有效改善腎組織管狀上皮細(xì)胞的代謝改變，調(diào)控能量代謝，改善SAKI不良預(yù)后[9]。研究證明，VEGFA通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。本實(shí)驗(yàn)通過建立PE大鼠模型，探究其對(duì)PE腎損傷的保護(hù)作用以及對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果證實(shí)，VEGFA是miR-21-3p的靶基因，進(jìn)一步研究顯示，miR-21-3p表達(dá)增加后，VEGFA的mRNA以及蛋白水平的相對(duì)表達(dá)受到抑制，另外還抑制了PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)和PE大鼠的炎癥反應(yīng)，腎損傷也明顯減輕。以上結(jié)果提示miR-21-3p通過下調(diào)VEGFA表達(dá)抑制PI3K活化，導(dǎo)致下游AKT失活，進(jìn)而改善PE大鼠腎損傷。

綜上所述，miR-21-3p通過靶向VEGFA抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，改善PE腎損傷，可能為臨床治療PE提供一些參考。但由于PE的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，miR-21-3p的靶點(diǎn)通路較多，還需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。