曹 陽， 賀曉燁， 李雯莉， 高冉冉， 王 瑩

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830000 2.云南省昆明市婦幼健康服務(wù)中心基層指導(dǎo)科， 云南 昆 明 650000)

隨著乙型肝炎疫苗(hepatitis B vaccine，HepB)應(yīng)用范圍推廣，免疫失敗問題已逐漸引起廣泛關(guān)注，其機(jī)制可能與疫苗形成的免疫壓力導(dǎo)致HBV基因突變，進(jìn)而造成免疫逃逸存在密切聯(lián)系[1]。目前已經(jīng)證實(shí)乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)由大、中和小包膜蛋白組成，位于氨基酸99-169序列區(qū)域的高度親水性結(jié)構(gòu)域稱主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)，其中包含的a決定簇(aa124-147)是誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和免疫應(yīng)答的重要抗原表位，同時(shí)也是疫苗和抗病毒藥物作用靶點(diǎn)[2，3]。目前所用HepB為HBsAg重組蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要針對S基因編碼的MHR區(qū)域，因此S基因突變，尤其MHR中的a決定簇突變?nèi)菀自斐梢呙缑庖呤?，?dǎo)致乙肝疫苗免疫逃避病毒(vaccine escaped HBV，ve-HBV)出現(xiàn)[4]。本研究以1973例接種HepB的人群為樣本，分析免疫逃逸發(fā)生情況及其與HBV S區(qū)基因突變的關(guān)系，以進(jìn)一步明確免疫失敗的遺傳學(xué)機(jī)制，現(xiàn)將具體結(jié)果詳述如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2021年3月至2022年3月我院1973例住院患者為樣本進(jìn)行橫斷面研究，其中男性1005例，女性968例，年齡3～28歲，平均(17.29±5.46)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均按照衛(wèi)生部《預(yù)防接種工作規(guī)范》[5]中規(guī)定的0、1、6月標(biāo)準(zhǔn)程序完成HepB接種；②均采集血液樣本并完成HBV感染標(biāo)志物檢測；③患者或家屬均了解本研究內(nèi)容并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并手術(shù)或輸血相關(guān)病史；②合并甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人類免疫缺陷病毒(HIV)等其它病毒感染；③合并免疫系統(tǒng)疾?。虎茉邮芸共《舅幬镏委?；⑤臨床信息不完整。

1.2研究方法

1.2.1HBV血清標(biāo)志物檢測：采集所有研究對象血液樣本3mL，以8000r/min離心后3min，取上清100μL并采用Access2全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國Beckman Coulter公司)及配套試劑盒檢測HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc，所有步驟均嚴(yán)格按照說明書要求完成。

1.2.2HBV DNA提?。喝BsAg陽性患者血清200μL于離心管中，然后加入20μL蛋白酶K(德國Qiagen公司)，震蕩15s以充分混勻，然后于56℃環(huán)境孵育10min，完成后加入無水乙醇200μL，搖勻后轉(zhuǎn)移至收集管離心柱中，在室溫條件下以8000r/min離心1min，更換清潔收集管并向離心柱加入500μL AW1洗液，在室溫條件下以8000r/min離心1min，去濾液并更換收集管，然后向離心柱加入500μL AW2洗液，在室溫條件下以16000r/min離心3min并去除濾液，將離心柱置于1.5mL無菌EP管中，加入30μL AE洗脫液并在室溫條件下以8000r/min離心1min，將所得DNA溶液-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3HBV DNA擴(kuò)增：采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪反應(yīng)體系包括10 mM dNTP 2μL，模板DNA 2μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶體系12.5μL、10×PCR buffer 5μL及雙蒸水26.5μL，總體積50μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性10min，然后98℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物科技有限公司合成，上、游序列分別為5’-ATCCGCTGGATGTGTCTGCG G-3’，下游5’-GGCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’。第二輪反應(yīng)體系包括第一輪PCR產(chǎn)物5μL，上、下游引物各2μL，Premix Taq DNA聚合酶25μL，雙蒸水16μL，總體積為50μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性10min，然后98℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物科技有限公司合成，上、游序列分別為5’-TTAGGG TTTAAATGTA TACCC-3’，下游5’-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3’。將PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓100V，時(shí)間40min，采用紫外多功能凝膠成像儀(法國Vilber Lourmat公司)觀察目標(biāo)條帶。

1.2.4HBV S基因型和血清型分析：取凝膠電泳產(chǎn)物置于EP管中，封口后送交上海生工生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果整理后與NCBI基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中標(biāo)準(zhǔn)序列(見表1)進(jìn)行對比和分析，采用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并鑒定基因型，HBV S基因型判斷依據(jù)為與參考序列S基因同源性≥96%為同一基因型。采用MegAlign軟件分析HBV S基因序列，比對并判斷突變發(fā)生情況。然后分析S基因中特定位點(diǎn)氨基酸表達(dá)情況確定血清型，HBV S共包括adr、adw、ayr和ayw等4種血清型。

表1 HBV S基因型標(biāo)準(zhǔn)參考序列

2 結(jié) 果

2.1HepB疫苗免疫逃逸患者流行病學(xué)分布：本研究1973例患者中HBsAg陽性標(biāo)本47份(2.38%)，其中HBsAg/抗-HBc陽性標(biāo)本26份，占55.32%，HBsAg/抗-HBs/抗-HBc陽性標(biāo)本3份，占6.38%，HBsAg且抗-HBs/抗-HBc陰性標(biāo)本18份，占38.30%。年齡>18歲者HBsAg陽性率高于1-18歲人群，父母HBV陰性者HBsAg陽性率低于母親HBV陽性人群，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，流行病學(xué)分布特征詳見表2。

表2 HepB疫苗免疫逃逸患者流行病學(xué)分布

2.2HBV基因型和血清型分析：47份HBsAg陽性標(biāo)本中HBV基因型包括B型14例(29.79%)，C型31例(65.96%)和D型2例(4.26%)；血清型包括adr型23例(48.94%)，adw型14例(29.79%)、ayr型8例(17.02%)和ayw型2例(4.26%)，見表3。

表3 HBV基因型和血清型分析

2.3HBV S基因突變位點(diǎn)數(shù)量分析：與標(biāo)準(zhǔn)序列相比，47份HBsAg陽性標(biāo)本共存在核苷酸突變位點(diǎn)162個(gè)，其中突變位點(diǎn)數(shù)量1-13個(gè)，平均(3.45±1.06)個(gè)，突變位點(diǎn)眾數(shù)為3個(gè)。47份標(biāo)本共存在氨基酸突變位點(diǎn)98個(gè)，其中突變位點(diǎn)數(shù)量0-6個(gè)，平均(2.09±68)個(gè)，30份HBsAg陽性標(biāo)本檢出氨基酸變異，檢出率63.83%，見圖1。

圖1 HBsAg陽性標(biāo)核苷酸和氨基酸突變情況分析

2.4HBV S區(qū)域核苷酸變異情況分析：基因測序顯示HBV S基因突變主要發(fā)生于MHR，47份標(biāo)本中a決定簇(aa124-147)內(nèi)檢出突變位點(diǎn)包括I/T126A/N/I/S、Q129H/R、M133L、K141E、T143S、D144A/EH和G145R/A；a決定簇上游(aa99-123)檢出突變位點(diǎn)包括Q101R/H、L110I、G112K、S113T/G、S117G和P120Q/R/L；a決定簇下游(aa148-169)檢出突變位點(diǎn)包括Y161F/C、E164D、F161Y和R160K，詳見表4。

表4 HBV S區(qū)域核苷酸變異情況分析

2.5HBV S基因a決定簇氨基酸變異情況分析：30份發(fā)生氨基酸變異的HBsAg標(biāo)本中，19份存在氨基酸極性改變，占63.33%，其中14份為B亞型毒株，且有11份發(fā)生于a決定簇(aa124-147)內(nèi)，包括T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等5個(gè)變異位點(diǎn)，分別導(dǎo)致第126位氨基酸由蘇氨酸(Thr)突變?yōu)楸彼?Ala)，第129位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)突變?yōu)榫彼?Arg)，第143位氨基酸由賴氨酸(Lys)突變?yōu)榈鞍彼?Met)，第145位氨基酸由甘氨酸(Gly)突變?yōu)锳la。

3 討 論

HBV感染是全球重要公共衛(wèi)生問題，文獻(xiàn)報(bào)道約有20億人為HBV感染者或伴感染病史，其中持續(xù)感染者數(shù)量約2.92億，可引起肝炎、肝硬化或肝癌等嚴(yán)重病變，且每年致約60萬患者死亡[6]。我國為HBV主要流行地區(qū)之一，現(xiàn)階段感染者數(shù)量約8600萬，自1992年國內(nèi)開始實(shí)施新生兒乙肝計(jì)劃免疫項(xiàng)目以來，HBV感染率呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，但免疫失敗率約5%～10%，因此探討免疫失敗發(fā)生機(jī)制對HBV感染預(yù)防和治療具有重要意義[7]。

本研究以1973例按照0、1、6月標(biāo)準(zhǔn)程序接種HepB疫苗的患者為樣本進(jìn)行橫斷面分析，結(jié)果顯示其中HBsAg陽性者47例，陽性率為2.38%，較我國60歲以下居民HBV攜帶率7.18%明顯降低[8]，表明接種疫苗對預(yù)防HBV感染具有積極作用，同時(shí)也提示我國居民接種HepB疫苗后仍然存在一定免疫逃逸風(fēng)險(xiǎn)，因此HBV感染風(fēng)險(xiǎn)較高的人群需加強(qiáng)體檢和監(jiān)測，以便及時(shí)采取預(yù)防和治療措施。同時(shí)本研究分析HBsAg陽性患者流行病學(xué)特征顯示，年齡>18歲者HBsAg陽性率明顯高于1-18歲人群，其原因可能與近年來疫苗接種技術(shù)快速進(jìn)步密切相關(guān)，且1-6歲兒童HBsAg陽性率僅0.97%，達(dá)到衛(wèi)生部提出的1%以下的要求。關(guān)于家族史的分析結(jié)果顯示父母HBV陰性者HBsAg陽性率明顯低于母親HBV陽性人群，可見HepB疫苗免疫逃逸可能與胎兒在功能已獲得感染存在密切聯(lián)系，從而導(dǎo)致母嬰傳播阻斷失敗。

基因型和血清型對判斷HBV傳播路徑具有重要參考意義，文獻(xiàn)報(bào)道HBV共包括A-J等10種基因型，其中分布于我國的主要為B、C和D三個(gè)亞型，優(yōu)勢血清型則為adr型，其次為adw型，因不同血清對HepB疫苗反應(yīng)效果存在差異，因此免疫失敗患者HBV血清型分布也可能發(fā)生變化[9]。本研究47份HBsAg陽性標(biāo)本HBV基因型主要為B型(29.79%)，其次則為C型(65.96%)，另外發(fā)現(xiàn)D型2例(4.26%)。HBV血清型有S基因a決定簇產(chǎn)生，根據(jù)第122位和第160位氨基酸位點(diǎn)突變情況分為adw、adr、ayw和ayr等4種亞型，本研究47份HBsAg陽性標(biāo)本血清型包括adr型23例(48.94%)，adw型14例(29.79%)、ayr型8例(17.02%)和ayw型2例(4.26%)，與全國流行規(guī)律相比無明顯差異[10]。由于樣本容量偏小，本研究未根據(jù)性別、年齡和家族史等口學(xué)特征進(jìn)一步分析，因此HBV基因型和血清型與HepB疫苗免疫失敗是否存在聯(lián)系，以及不同亞型免疫逃逸風(fēng)險(xiǎn)是否具有差異均還有待深入探討。

近年來研究表明位于MHR(aa99-169)尤其a抗原決定簇(aa124-147)突變是影響HBsAg抗原性的重要因素，在自然條件、HepB疫苗或抗病毒藥物等作用下，a抗原決定簇突變導(dǎo)致HBsAg構(gòu)象改變和抗原性變化，造成免疫逃逸[11]。Colagrossi等[12]對828位慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者進(jìn)行分析，結(jié)果顯示耐藥誘導(dǎo)的免疫逃逸檢出率為28.6%，主要包括rtM204IsI196S、rtM204V-sI195M和rtV173L-sE164D等。本研究采用PCR技術(shù)對HBV S基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示47份HBsAg陽性標(biāo)本共存在核苷酸突變位點(diǎn)162個(gè)和氨基酸突變位點(diǎn)98個(gè)，明確存在氨基酸變異的標(biāo)本為30份，檢出率63.83%，表明HepB疫苗免疫逃逸主要與HBV S基因有關(guān)。同時(shí)本研究基因測序顯示HBV S基因突變主要發(fā)生于MHR，其中a決定簇(aa124-147)內(nèi)部突變發(fā)生率為53.20%，主要位點(diǎn)包括I/T126A/N/I/S、Q129H/R、M133L、K141E、T143S、D144A/EH和G145R/A等；a決定簇上游(aa99-123)突變發(fā)生率為87.24%，主要位點(diǎn)包括Q101R/H、L110I、G112K、S113T/G、S117G和P120Q/R/L等；a決定簇下游(aa148-169)突變發(fā)生率為80.85%，主要位點(diǎn)為Y161F/C、E164D、F161Y和R160K；可見發(fā)生HepB疫苗免疫逃逸的HBV毒株S基因突變情況較為復(fù)雜，可能同時(shí)存在a決定簇內(nèi)外多個(gè)位點(diǎn)突變。為進(jìn)一步明確HBV S基因突變與HepB疫苗免疫逃逸的關(guān)系，本研究對氨基酸突變類型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)30份發(fā)生氨基酸變異的HBsAg陽性標(biāo)本中，有19份存在氨基酸極性改變，占63.33%，且11份位于a決定簇內(nèi)，是引起HepB疫苗免疫逃逸的主要原因。本研究檢測出的氨基酸突變包括T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等5個(gè)位點(diǎn)，其中T126I導(dǎo)致Thr突變?yōu)锳la，T143S導(dǎo)致LysMet，G145A導(dǎo)致Gly突變?yōu)锳la，均使氨基酸由極性和親水性和向非極性和疏水性轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致抗原與抗體反應(yīng)性下降，形成免疫逃逸。此外本研究顯示Q129R突變可將第129位氨基酸由Gln突變?yōu)锳rg，親水性和抗原性均一定程度升高，但可能是由于多點(diǎn)位突變的關(guān)系，仍然導(dǎo)致免疫逃逸的結(jié)果發(fā)生。

綜上所述，HBV S基因突變與HepB疫苗免疫逃逸存在密切聯(lián)系，其中a決定簇(aa124-147)內(nèi)部T126I、Q129R、T143S、D144A和G145A等位點(diǎn)突變可引起HBsAg極性和親水性變化，從而導(dǎo)致抗原性下降，造成免疫逃逸發(fā)生。本研究主要不足之處為未對不同突變情況下HBsAg結(jié)構(gòu)進(jìn)行微觀分析，尤其當(dāng)多位點(diǎn)突變同時(shí)存在時(shí)，HBsAg抗原性變化情況還有待后續(xù)開展更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究，另外還有一部分無義突變和沉默突變與HepB疫苗免疫逃逸的關(guān)系也還有待探討和證實(shí)。