田守潤，勾艷芳，王錦哲，樊芮伽，唐歷波

1.海南醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，海南 ?？?570145；

2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)院，海南 ?？?570145

肝是機體中最大的消化腺，由肝細胞和多種不同種類的非實質(zhì)細胞組成[1]，承擔(dān)著重要的生理功能，肝細胞是肝組織的基本單位，占肝臟總質(zhì)量的60%～80%[2]，是肝臟完成生理功能的基礎(chǔ)[3]。肝細胞的原代培養(yǎng)具有一定的歷史。目前，原代肝細胞分離提取方法主要有組織塊法、膠原酶原位灌注法、Seglen兩步膠原酶灌注法[4]。國內(nèi)外應(yīng)用最廣的方法是Seglen兩步灌注法[5]分離培養(yǎng)原代肝細胞，可分離成體肝組織細胞，為肝細胞分離培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但步驟繁瑣，一般實驗室難于完成。王珊等[6]比較了3種不同培養(yǎng)條件下原代小鼠肝細胞的形態(tài)以及肝細胞功能，尋找出了適合于原代小鼠肝細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，即：發(fā)現(xiàn)了小鼠原代肝細胞培養(yǎng)基中加入二甲基亞砜(DMSO)對于維持肝細胞的形態(tài)和功能有促進作用，為體外原代肝細胞培養(yǎng)模型的建立和優(yōu)化提供了實用的方法。但是由于可重復(fù)性差以及個體差異性而無法全面推廣。因此，如何找到一種簡便且普及較好方法有待研究。小鼠肝細胞的分離培養(yǎng)與鑒定是肝組織工程的基礎(chǔ)，在人工肝構(gòu)建、體外藥物測試模型構(gòu)建以及3D打印可移植肝組織等方面具有重要作用。許多實驗室在經(jīng)典的兩步法培養(yǎng)肝細胞的基礎(chǔ)上不斷簡化優(yōu)化培養(yǎng)方法[7-8]。本實驗采用簡單的膠原酶分離法，對培養(yǎng)的肝細胞克隆進行篩選，分離得到小鼠肝細胞克隆，免疫組化鑒定結(jié)果表明，利用簡易膠原酶消化法可獲得原代肝細胞，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器及材料高糖-DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，北京)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，布宜諾斯艾利斯，阿根廷)，12、96孔培養(yǎng)板(NUNC公司，丹麥)，小鼠抗大鼠CK-19熒光抗體(1∶10 BOSTER公司，美國)，WST-1試劑盒(Abcam公司，英國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)。實驗材料為2～3日齡小鼠，雌雄不限，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細胞分離培養(yǎng)方法將1日齡小鼠用70%酒精浸泡1 min消毒，移入超凈臺，在培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎小鼠肝臟，生理鹽水沖洗血液至組織發(fā)白，在冰浴條件下放置于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖(PBS)溶液中剪碎肝組織至勻漿狀，PBS沖洗兩次，加入3倍體積的0.1%膠原酶Ⅰ，37℃下消化1 h，加入含10%的胎牛血清(FBS)高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打成懸液200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心5 min，沉淀用培養(yǎng)液重懸，按104/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。3 d后達80%密度時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 免疫化學(xué)染色鑒定小鼠肝細胞將培養(yǎng)3～4代的細胞收集，按106/mL濃度接種至小腸黏膜脫細胞基質(zhì)膜上，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次，滴加CK-19熒光抗體室溫下染色30 min傾去存留的熒光抗體，PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下鏡檢觀察。

1.2.3 細胞成活率及生長曲線測定0.4%臺盼藍拒染法檢測分離肝細胞的成活率，倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，統(tǒng)計未染色的活細胞占總細胞數(shù)的比例即為細胞成活率。細胞生長曲線測定：利用24孔板分別接種原代肝細胞，分別培養(yǎng)1～14 d，每個時間點取三孔棄去培養(yǎng)基，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基加20 μL WST-1，培養(yǎng)2 h，每孔吸取180 μL至96孔板，在酶標(biāo)儀中450 nm下得到吸光度值A(chǔ)450，該吸光度值與細胞增殖數(shù)成正比，從而得到肝細胞增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細胞鏡下觀察初次分離的原代肝細胞呈卵圓形，核大，邊緣清晰透亮(圖1)，48 h后細胞開始貼壁生長，細胞變成長梭形(圖2、圖3)，5～7 d達到80%生長密度，細胞呈鋪路石狀排列(圖4)。8 d后有死細胞產(chǎn)生并漂浮在培養(yǎng)液中。

圖1 原代分離小鼠肝細胞(400×)

圖2 48 h肝卵圓細胞貼壁生長(400×)

圖3 貼壁生長肝細胞呈長梭形(400×)

圖4 7 d肝細胞呈鋪路石狀排列(400×)

2.2 小鼠肝細胞原代培養(yǎng)成活率臺盼藍拒染實驗表明，1 g小鼠肝臟可分離肝細胞1.2×105，原代分離活細胞比例為72%。

2.3 原代肝細胞生長特點通過生長曲線繪制可知，原代肝細胞貼壁生長后，有一個快速增長期，一般在5～7 d后達到增殖高峰，隨后增殖能力逐漸下降(圖5)，若繼代培養(yǎng)，可恢復(fù)增殖能力，一般3～5代增殖能力最強。

圖5 小鼠肝細胞生長曲線繪制

2.4 小鼠肝細胞與膜復(fù)合將3～5代肝細胞按1×106個/mL細胞濃度以滴加法滴注到豬小腸黏膜下層脫細胞基質(zhì)膜(以下簡稱：SIS)，按0.1 mL/cm2將處于對數(shù)生長期的肝細胞與SIS復(fù)合，肝細胞在膜上能夠分裂增殖(圖6、圖7)。免疫熒光染色表明，小鼠肝細胞可以在SIS膜上生長(圖8)。

圖6 肝細胞與SIS復(fù)合(40×)

圖7 肝細胞在SIS上分裂增殖(40×)

圖8 CK-19免疫熒光染色，示肝細胞在SIS膜上生長(40×)

3 討論

中國是肝病大國，包括乙肝、肝癌、肝損傷等引發(fā)的急性肝衰竭威脅著人類的健康。分離培養(yǎng)肝細胞是肝組織工程及人工肝系統(tǒng)制備的基礎(chǔ)。小鼠是模式生物，體外分離培養(yǎng)小鼠肝細胞在細胞生物學(xué)、毒理學(xué)、異種人工肝系統(tǒng)研制以及藥理學(xué)等方面具有重要意義。肝細胞的分離培養(yǎng)方法多種多樣，其中，經(jīng)典的膠原酶兩步灌流法是肝細胞分離培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。但此法的缺點是所需膠原酶量大、成本高。一次性灌注消化一只成年大鼠肝臟需要75～100 mg膠原酶，浪費嚴重，而且需要蠕動泵[10-12]等，同時由于處理時間長，容易出現(xiàn)返流而造成培養(yǎng)污染，獲得的分裂細胞為處于靜息期的肝成體細胞，分裂傳代能力有限，限制了該方法的廣泛利用[13]。李素婷等[14]采用組織塊方法分離培養(yǎng)小鼠肝組織細胞，肝細胞從組織塊周邊爬出，成活率較高，操作方法簡單，但細胞爬出困難，數(shù)量有限，細胞培養(yǎng)周期長，難以形成細胞的群落效應(yīng)?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的Wnt信號通路中有19種蛋白參與了細胞生長分化和胚胎形成及腫瘤發(fā)生過程[15]。彭利等[16]證實Wnt3a能夠誘導(dǎo)HP14-19向成熟肝細胞分化。為肝細胞原代培養(yǎng)提供了又一新進展。因此，運用CK19免疫熒光可以鑒定肝細胞向成熟化分化的標(biāo)志。本實驗采用眼科剪在冰浴條件下剪碎肝組織，用膠原酶消化組織并釋放出肝細胞，方法簡單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，同時細胞存活率較高，適合于一般實驗室分離培養(yǎng)肝細胞。但缺陷也是顯而易見的：酶消化時間難以掌握，消化時間過長，容易造成細胞的損傷死亡，時間過短，細胞難以從組織中解離出來。本實驗與經(jīng)典的兩步灌流法相比，雖然細胞純度和細胞存活率都較低，但對普通實驗室分離肝細胞是一個很好的選擇方法。

新生小鼠肝組織含有多種類型細胞，血細胞會影響肝細胞的貼壁生長，在冰浴上剪碎組織塊后通過簡單的離心處理，即可分離脫除肝組織中的血細胞。眼科剪的剪切力會對部分細胞產(chǎn)生損傷作用，但剪切主要破壞細胞外基質(zhì)，更有利于肝卵圓細胞從組織中釋放出來。肝組織中細胞種類較多，包括各種類型肝干細胞、肝星形膠質(zhì)細胞、造血干細胞以及間充質(zhì)干細胞。分離純化肝干細胞方法有許多種，包括物理機械分離法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法以及熒光流式細胞分選法。本實驗采用物理機械分離法去除造血干細胞和間充質(zhì)干細胞，利用貼壁快慢差異，并結(jié)合克隆篩選分離肝卵圓細胞，不斷傳代培養(yǎng)，雜細胞越來越少。利用CK-19免疫熒光染色證明分離到的克隆為肝卵圓細胞。

離體培養(yǎng)肝卵圓細胞具有接觸抑制現(xiàn)象，并形成鋪路石形狀。而本實驗將處于對數(shù)分裂期的肝細胞接種至SIS膜上，使細胞能夠分裂生長并形成立體結(jié)構(gòu)。細胞增殖實驗表明，肝細胞在SIS膜上能夠正常分裂并形成細胞克隆。細胞在膜上生長并在三維立體空間中建立相互聯(lián)系是形成組織的前提，在骨組織工程研究中有一個“膜誘導(dǎo)再生理論”明確指出膜在形成組織中的作用[17]，而組織的形成本質(zhì)上是細胞的有序行為。生命科學(xué)的一大基礎(chǔ)難題就是有序性形成的機制，在分子水平，不同的生物大分子通過自組裝或分子間相互作用形成功能性分子；在細胞水平，通過細胞間通訊形成有功能的組織；而在生物個體水平，通過信息的交流和控制實現(xiàn)了生物的社會性。因此，體外在膜上開展細胞間相互作用有助于揭示組織形成的奧秘。