杜娟，何莉茹，王艷艷，王粉玲，金大永

1.西安市北方醫(yī)院婦科，陜西 西安 710043；

2.西安市大興醫(yī)院影像科，陜西 西安 710016

腫瘤是一種基因病也是一種代謝病。近年來越來越多的研究表明，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞的代謝特征發(fā)生了顯著改變，即代謝重編程[1]。目前，細(xì)胞代謝重編程已被公認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞最重要的“十大特征”[2]。腫瘤細(xì)胞代謝重編程主要表現(xiàn)為三大營養(yǎng)物質(zhì)糖、脂與氨基酸代謝的異常改變。其中，糖代謝重編程是發(fā)現(xiàn)最早、關(guān)注度最高的腫瘤細(xì)胞代謝特征[3]。腫瘤細(xì)胞糖代謝重編程于20世紀(jì)20年代由德國化學(xué)家Warburg首次報道，他發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在氧氣充足時仍主要通過糖酵解而非氧化磷酸化的方式產(chǎn)生能量，該現(xiàn)象也被稱為“瓦伯格”效應(yīng)。此后，越來越多的研究在包括卵巢癌在內(nèi)多種惡性腫瘤中證實(shí)了該現(xiàn)象的存在，并發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段均發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[4]。然而目前，腫瘤有氧糖酵解增強(qiáng)背后的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

線粒體在細(xì)胞能量代謝調(diào)控中發(fā)揮核心作用[5-6]，其形態(tài)與功能受自身分裂與融合過程的精密調(diào)控[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中多個線粒體分裂與融合蛋白存在表達(dá)與活性的異常變化，通過調(diào)控線粒體形態(tài)與功能促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[9-10]。膜相關(guān)鋅指蛋白5(membrane-associated RING-CH 5，MARCH5)是線粒體定位的E3泛素連接酶，通過影響線粒體分裂蛋白表達(dá)而調(diào)控線粒體形態(tài)與功能[11]。卵巢癌中研究發(fā)現(xiàn)，MARCH5表達(dá)上調(diào)具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲與遷移的作用[12]，但作為線粒體定位的E3泛素連接酶，MARCH5是否調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝重編程仍不十分清楚。

本研究首次在卵巢癌細(xì)胞中分析MARCH5對細(xì)胞糖代謝的調(diào)控作用，包括糖酵解與線粒體氧化磷酸化。本研究將有助于加深對腫瘤細(xì)胞代謝重編程發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識，從而為腫瘤治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。小牛血清購自杭州四季青生物公司。葡萄糖與乳酸檢測試劑盒均購自南京建成生物公司(貨號分別為：F019-2-1與F006-1-1)、ATP含量檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司(貨號：S0026)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)箱含5%濃度的CO2，溫度為37℃。(1)siRNA合成與細(xì)胞轉(zhuǎn)染：委托吉凱生物公司合成兩條靶向MARCH5的siRNA干涉片段：干涉片段1(siMARCH5#1)序列為：5'-GCACUUGGGAGUAAUUUGA-3'；干涉片段2(si-MARCH5#2)序 列 為：5'-GCACACGUGUCCGAUUUAU-3'；陰性對照干涉片段(siCtrl)序列為：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。將合成好的siRNA干涉片段用脂質(zhì)體lip2000為載體轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)。(2)轉(zhuǎn)染流程：首先，將3×105個SKOV3細(xì)胞接種至6孔板并培養(yǎng)過夜，分別用不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋siRNA干涉片段與脂質(zhì)體lip2000，隨后將稀釋好的siRNA與脂質(zhì)體lip2000混勻并加入6孔板細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)6 h更換含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)采用OMEGA公司的RNA提取試劑盒(貨號R6688)進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，隨后用購自TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號RR037A)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后進(jìn)行MARCH5分子的mRNA表達(dá)檢測。MARCH5引物序列為：F-5'-GTCCAGTGGTTTACGTCTTGG-3'；R-5'-CCGA-CCATTATTCCTGCTGC-3'。內(nèi) 參β-actin引 物 序 列為：F-5'-TCGCCTTTGCCGATCCG-3'；R-5'-ATGATC-TGGGTCATCTTCTCG-3'。各組細(xì)胞MARCH5分子的相對mRNA表達(dá)計(jì)算用2-△△Ct法。

1.2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)將含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液加入細(xì)胞，于冰上裂解30 min后離心收集上清。加入SDS上樣緩沖液后煮沸5 min，隨后于10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，于5%的BSA中封閉1 h后加入稀釋過的MARCH5抗體(Novus Biologicals，貨 號NBP2-21583)與β-actin抗 體(Proteintech，貨號20536-1-AP)。TBST溶液洗3次后加入稀釋過的二抗，室溫孵育1.5 h后用TBST洗3次。最后，加入發(fā)光液進(jìn)行結(jié)果觀察。

1.2.4 葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)分別于細(xì)胞培養(yǎng)0 h與12 h收集培養(yǎng)上清，用葡萄糖濃度檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液中葡萄糖含量，培養(yǎng)0 h與12 h培養(yǎng)液中葡萄糖含量的差值代表細(xì)胞攝取利用的葡萄糖。葡萄糖濃度檢測嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，每個樣品重復(fù)3個孔，最終結(jié)果用細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.5 乳酸生成實(shí)驗(yàn)分別于細(xì)胞培養(yǎng)0 h與培養(yǎng)12 h收集細(xì)胞上清，用乳酸濃度檢測試劑盒檢測乳酸含量，培養(yǎng)0 h與12 h培養(yǎng)液中乳酸含量的差值代表細(xì)胞代謝分泌的乳酸。乳酸濃度檢測嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，每個樣品重復(fù)3個孔，最終結(jié)果用細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.6 細(xì)胞氧氣消耗速率檢測采用德國漢莎公司的氧電極對細(xì)胞氧氣消耗速率進(jìn)行檢測。大致檢測流程：首先對電極進(jìn)行清潔，設(shè)定實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度為28℃，在無細(xì)胞的培養(yǎng)液體中建立零氧耗曲線，之后加入待測細(xì)胞進(jìn)行氧耗檢測，最終結(jié)果用細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.7 ATP含量檢測棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞兩次，加入裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清。用裂解液梯度稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品。將100 μL的ATP檢測工作液與同體積的待測樣品或梯度ATP標(biāo)準(zhǔn)品混合后加入96孔板，室溫放置5 min后讀取吸光值。最終結(jié)果用細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2.8 質(zhì)譜檢測糖酵解與線粒體三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物首先，按以下流程制備樣品：棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS清洗細(xì)胞兩次，加入500 μL的純水后于-80℃冷凍30 min，隨后于37℃放置30 min進(jìn)行融解，重復(fù)以上冷凍與融解步驟3次。用移液器收集上清，加入1.5 mL的甲醇，12 000×g離心10 min。收集上清并揮干后將樣品送至上海中科新生命生物公司，用氣象色譜與飛行時間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)平臺對糖酵解與三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。最終結(jié)果用細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析與LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干涉MARCH5抑制卵巢癌細(xì)胞的葡萄糖攝取與乳酸產(chǎn)生首先，將合成的兩條靶向MARCH5的siRNA干涉片段轉(zhuǎn)染入卵巢癌SKOV3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后提取細(xì)胞總RNA與蛋白，分別用qRT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染siRNA干涉片段對MARCH5表達(dá)的干涉效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組(siCtrl)SKOV3細(xì)胞相比，MARCH5干涉組1與干涉組2細(xì)胞的MARCH5表達(dá)在mRNA[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.02)∶(0.25±0.01)∶(0.23±0.01)，圖1A]與蛋白水平[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(0.81±0.03)∶(0.25±0.01)∶(0.29±0.02)，圖1B]均顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA干涉片段對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中MARCH5表達(dá)的下調(diào)效率

隨后，用商品化試劑盒檢測細(xì)胞的葡萄糖攝取與乳酸產(chǎn)生后發(fā)現(xiàn)：與對照組(siCtrl)SKOV3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3細(xì)胞的葡萄糖攝取[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.06)∶(0.45±0.02)∶(0.44±0.02)，圖2A]與乳酸產(chǎn)生[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.05)∶(0.36±0.02)∶(0.35±0.03)，圖2B]均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示下調(diào)MARCH5抑制了卵巢癌細(xì)胞的有氧糖酵解。

圖2 干涉MARCH5對卵巢癌SKOV3細(xì)胞葡萄糖攝取與乳酸產(chǎn)生的影響

2.2 干涉MARCH5可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的氧化磷酸化進(jìn)一步探討干涉MARCH5表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞氧耗速率與ATP生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組(siCtrl)SKOV3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3細(xì)胞的氧氣消耗速率[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(3.15±0.10)∶(5.73±0.14)∶(5.67±0.11)，圖3A]與ATP生成均顯著上調(diào)[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.04)∶(1.69±0.06)∶(1.74±0.07)，圖3B]，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明下調(diào)MARCH5表達(dá)促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的氧化磷酸化。

圖3 干涉MARCH5對SKOV3細(xì)胞氧氣消耗速率與ATP產(chǎn)生的影響

2.3 干涉MARCH5可降低卵巢癌細(xì)胞內(nèi)糖酵解中間代謝產(chǎn)物含量，而增加三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物含量用色譜質(zhì)譜技術(shù)分析干涉MARCH5表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中糖酵解與三羧酸循環(huán)主要代謝中間產(chǎn)物水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組(siCtrl)SKOV3細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染靶向MARCH5干涉片段的SKOV3細(xì)胞內(nèi)糖酵解中間代謝產(chǎn)物葡萄糖[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.11)∶(0.47±0.04)∶(0.46±0.03)]、丙酮酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(0.61±0.03)∶(0.59±0.05)]與乳酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(0.36±0.02)∶(0.37±0.05)]水平均顯著降低(圖4A)，而三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物檸檬酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.07)∶(2.60±0.08)∶(2.53±0.13)]、延胡索酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.04)∶(1.70±0.10)∶(1.67±0.08)]與蘋果酸[siCtrl∶siMARCH5#1∶siMARCH5#2=(1.00±0.08)∶(2.15±0.08)∶(2.14±0.11)]水平均明顯增多(圖4B)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。進(jìn)一步表明干涉MARCH5具有抑制卵巢癌細(xì)胞糖酵解與激活氧化磷酸化的作用。

圖4 干涉MARCH5對卵巢癌SKOV3細(xì)胞糖酵解與三羧酸循環(huán)主要中間產(chǎn)物的影響

3 討論

新陳代謝是生命活動的基本形式，主要包括物質(zhì)與能量代謝。正常情況下，細(xì)胞主要通過攝取外界環(huán)境中的葡萄糖與氧氣，在線粒體中進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生能量ATP，供給細(xì)胞生命活動所需[13]。當(dāng)氧氣缺乏時，細(xì)胞主要通過無氧糖酵解進(jìn)行能量產(chǎn)生。大量研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞不同的是，腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足時仍主要以糖酵解方式進(jìn)行物質(zhì)與能量代謝，該現(xiàn)象也被稱為“瓦伯格”效應(yīng)[14-15]。糖酵解不但為腫瘤細(xì)胞快速增殖提供了合成代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)與能量ATP，同時也可通過產(chǎn)生乳酸，為腫瘤細(xì)胞的侵襲提供有利條件[16]。

當(dāng)前，有氧糖酵解增強(qiáng)的機(jī)制始終是腫瘤代謝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題。研究表明，癌基因激活與抑癌基因失活在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解中發(fā)揮了重要作用。如研究發(fā)現(xiàn)，RAS與Myc等癌基因激活可通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)而激活細(xì)胞糖酵解，同時也可抑制氧化磷酸化關(guān)鍵調(diào)控蛋白表達(dá)而抑制線粒體的氧化磷酸化[17]。p53與PTEN等抑癌基因的失活也被證實(shí)可通過調(diào)控糖酵解與氧化磷酸化關(guān)鍵蛋白表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解[18-19]。此外，細(xì)胞內(nèi)多個代謝調(diào)控通路的激活也被證實(shí)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解，如研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號激活在腫瘤有氧糖酵解中扮演重要角色[20]。盡管上述研究已證實(shí)癌/抑癌基因及代謝相關(guān)信號通路在激活腫瘤細(xì)胞糖酵解中發(fā)揮重要作用。但目前，作為直接參與細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝調(diào)控的線粒體，其自身功能異常在腫瘤有氧糖酵解中的作用卻極少被關(guān)注。

MARCH5線粒體外膜定位的E3泛素連接酶，以往研究發(fā)現(xiàn)MARCH5可通過調(diào)控線粒體分裂蛋白Mid49的泛素化與降解，而抑制線粒體分裂[11]。卵巢癌中研究發(fā)現(xiàn)，與正常卵巢組織相比，MARCH5表達(dá)在卵巢癌組織中顯著升高，下調(diào)MARCH5表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移與侵襲[12]，表明MARCH5在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但作為線粒體定位的重要功能蛋白，MARCH5是否參與卵巢癌細(xì)胞糖代謝卻尚不清楚。本研究首次在卵巢癌中證實(shí)，MARCH5在促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞糖代謝重編程中扮演重要角色，MARCH5發(fā)揮了激活糖酵解并同時抑制氧化磷酸化的作用。以往在胰腺癌中的研究證實(shí)，線粒體分裂調(diào)控蛋白DRP1介導(dǎo)的線粒體分裂可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解[21]。肝癌中研究也表明，線粒體分裂蛋白DRP1介導(dǎo)的線粒體延長可通過調(diào)控線粒體嵴結(jié)構(gòu)而促進(jìn)細(xì)胞的氧化磷酸化抑制糖酵解[22]。上述研究提示，MARCH5可能通過調(diào)控線粒體分裂融合蛋白泛素化與降解，進(jìn)而調(diào)控線粒體形態(tài)與糖代謝重編程。然而，除線粒體分裂融合調(diào)控蛋白外，線粒體外膜上還分布著多個糖代謝調(diào)控蛋白，如丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MPC。當(dāng)MPC表達(dá)降低時，細(xì)胞糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸無法進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化磷酸化，只能在胞漿進(jìn)一步代謝生成乳酸[23]。因此，MARCH5調(diào)控卵巢癌細(xì)胞糖酵解的機(jī)制仍有待今后用免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

總之，本研究首次在卵巢癌細(xì)胞中證實(shí)了E3泛素連接酶MARCH5對有氧糖酵解的促進(jìn)作用，有助于加深對卵巢癌細(xì)胞有氧糖酵解增強(qiáng)機(jī)制的認(rèn)識，同時也將為腫瘤代謝治療提供潛在靶點(diǎn)。