曾華東 邱嫻 涂力 張丹丹 王君麗

根據(jù)世衛(wèi)組織的最新報告，與世界上其他癌癥相比，肺癌導致的死亡率最高。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數(shù)的85%。大量的危險因素歸因于肺癌的進展。表皮生長因子受體(EGFR)是最常見的突變驅(qū)動基因之一，通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MAPK途徑，密切參與肺癌的發(fā)展[1]。根據(jù)美國癌癥協(xié)會[1]最近的一項研究表明，在2020年最常見的癌癥中，肺癌約占12%～13%的新癌癥病例，估計造成的死亡人數(shù)最多，在男性和女性中分別占23%和22%。據(jù)報道，5年生存率低至19%，說明目前缺乏有效的長期治療[2]。肺癌的危險因素包括吸煙、環(huán)境污染、輻射、基因改變等。眾所周知，不受控制的增殖是最重要的癌細胞標志之一，并且在惡性腫瘤的癌變和進展中起著至關(guān)重要的作用。肺癌發(fā)病率與死亡率居高不下，其中非小細胞肺癌占比高達80%以上，包括腺癌、鱗癌及大細胞癌[3]。然而，長期預后已得到改善，中位生存期接近25～30個月，目前約有三分之一的患者存活5年[4]。這可能部分歸因于分期的改進，包括使用腦磁共振成像和氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描成像，在放射治療計劃和支持性護理方面的進展[5]。大多肺癌患者確診時已是晚期，通常采用放化療等癌癥控制方法，但預后較差，且容易復發(fā)[6]。在20多年沒有臨床進展的情況下，在鉑類化療中加入程序性細胞死亡蛋白1軸阻斷已經(jīng)證明了可以延長肺癌患者的生存期，并代表了當前一線治療的標準。但是耐藥性幾乎在所有患者中快速增加。

大約98%的人類基因組由非編碼DNA組成，這些DNA被轉(zhuǎn)錄成大量的非編碼RNA (ncRNAs)。通過對哺乳動物轉(zhuǎn)錄組的全面研究，人們發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計的長非編碼RNA (lncRNAs)，其長度為200 nt。大量的lncRNA研究表明，這些新的調(diào)控元件在人類疾病中高度失調(diào)，包括各種類型的癌癥。lncRNAs作為支架分子、結(jié)構(gòu)RNA和調(diào)控分子，在調(diào)控癌癥特征的所有方面的信號通路中發(fā)揮重要作用[7]。MAGI2-AS3是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在乳腺癌中發(fā)揮重要作用[8]。但其在肺癌中的研究報道較少。本研究通過體內(nèi)和體外實驗探究肺癌的分子機制，為肺癌的臨床治療奠定基礎。

資料與方法

一、細胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染

肺癌細胞系PG49購自中國科學院上海生命科學研究所(上海，中國)。細胞在DMEM (Gibco)中培養(yǎng)，添加10% (v/v)胎牛血清；青霉素(終濃度100u/mL)、鏈霉素(終濃度100mg/mL)，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將肺癌細胞系接種于60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中(每個平板接種約1.5×105個細胞)，用含有1 mmol/L TCP的DMSO(0.5%)溶液處理24 h或用0.5% DMSO溶液單獨處理24 h。24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天，然后提取總RNA用于RNA分析。

MAGI2-AS3 shRNA和陰性對照shRNA(sh-NC)由上海Gene Pharma公司完成。慢病毒包裝采用293T細胞，293T細胞在含有10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并每隔一天傳代一次。收集病毒，按轉(zhuǎn)染物不同分為：LV-GFP-N轉(zhuǎn)染組(oe-NC，轉(zhuǎn)染空載體)、LV-GFP-MAGI2-AS3轉(zhuǎn)染組(oe-MAGI2-AS3，慢病毒轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3過表達)。

待肺癌細胞系處于對數(shù)生長期時胰蛋白酶消化、吹打，制成5×104個/mL的細胞懸液并接種于6孔板，每孔2 mL，37 ℃培養(yǎng)過夜。再將病毒(1×108TU/mL)加入細胞中，侵染后48 h，通過熒光顯微鏡觀測GFP表達效率。

二、 qRT-PCR

根據(jù)說明書，使用 TRIzol 試劑 (Invitrogen) 從新鮮冷凍的 HCC 組織或轉(zhuǎn)染細胞中提取總 RNA。SYBR Green PCR Master Mix 用于在 ABI7300 實時 PCR 機器(Applied Biosystems)上進行 qRT-PCR 反應。 熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照基因。2^(-ΔCT)表示待測基因表達水平，ΔCT=CT(target)-CT(ref)，所用的特異性引物序列(見表1)。

表1 qRT-PCR的引物序列

三、 Western blot檢測蛋白表達

BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒 (Novagen) 用于量化蛋白質(zhì)濃度。來自每個樣品的蛋白質(zhì)通過 SDS-PAGE 分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 (Millipore) 中。用牛血清白蛋白封閉后，將所有膜與不同的一抗，在 4℃ 下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育。用增強的化學發(fā)光檢測膜中的蛋白質(zhì)條帶。通過 ImageJ 軟件量化條帶強度，并將數(shù)據(jù)標準化為 β-actin。在含有蛋白酶抑制劑的冰冷放射免疫沉淀測定緩沖液(Beyotime)中裂解細胞。在 4℃ 下以12 000 rpm離心20 min后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解物，并使用ECL 檢測試劑(Beyotime)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上進行蛋白質(zhì)印跡分析，并使用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

四、 EdU增殖檢測實驗

在96孔板中轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)細胞48 h后，吸去細胞培養(yǎng)液，每孔加入500 μL含EdU(25 μmol/L)培養(yǎng)基孵育2 h。經(jīng)固定(4%多聚甲醛，30 min)和通透(0.5% TfitonX-100，10 min)處理后，加入500 μL的Apollo?染色反應液(避光)，DAPI染核，最后獲取圖像并定量分析。

五、 細胞凋亡檢測

細胞凋亡/壞死檢測試劑盒(Abcam, ab176749)根據(jù)說明書使用。將細胞置于含有凋亡細胞Apopxin Green指示劑和健康細胞CytoCalcein指示劑的分析緩沖液中，在室溫下孵育1 h。用分析緩沖液洗滌細胞，使用Zeiss LSM 880在×10倍鏡下成像。激發(fā)/發(fā)射參數(shù):Apopxin Green-488/525 nm, CytoCalcein-405/450 nm。

六、Transwell細胞侵襲實驗

Transwell遷移實驗中，將轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的肺癌細胞接種到未包被的96孔插入物的上部。侵入性分析使用涂有Matrigel (BD Biosciences)的transwell室(康寧公司)進行。Matrigel在4 ℃解凍，以1:2的比例稀釋在DMEM中。轉(zhuǎn)染后，肺癌細胞(2×104)在上室不含胎牛血清的培養(yǎng)基和下室含胎牛血清-DMEM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。孵育36 h后，用棉簽去除過濾器頂部的細胞。浸潤過濾器下表面的細胞用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色。在光學顯微鏡下觀察細胞。

七、肺癌細胞小鼠移植癌模型

選擇48只SPF級，4～6周齡，體重21～30 g雌性裸小鼠為實驗動物，分為4組(n=12)，oe-NC、oe-MAGI2-AS3、sh-NC、sh-RACGAP1。各組慢病毒轉(zhuǎn)染6×106個/mL PG49細胞。細胞培養(yǎng)24 h，收集并注射到動物體內(nèi)。注射前，將細胞與基質(zhì)膠按體積比1:1混勻后，于裸鼠右側(cè)腋下接種3×106個細胞(0.2 mL懸液)。觀察腫瘤生長情況，兩天測量一次小鼠的體重和腫瘤大小。腫瘤大小計算公式：V(mm3)=1/2L×D2。飼養(yǎng)4周后CO2法處死裸鼠，剝離腫瘤，稱重。

八、 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料采用均值±標準差的形式表示，首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態(tài)分布且方差齊，則兩組間比較為非配對t檢驗，每組三次重復，多組間的比較應采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較，采用SNK-Q檢驗的方法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、 lncRNA MAGI2-AS3在肺癌細胞中的作用

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達MAGI2-AS3后，肺癌細胞系PG49中MAGI2-AS3相對表達量明顯增加(t=1.91，P<0.01)(見圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測各組lncRNA MAGI2-AS3轉(zhuǎn)染效率注：表示與oe-NC組相比：*P<0.05。

二、 lncRNA MAGI2-AS3對PG49細胞增殖的影響

EdU增殖實驗結(jié)果顯示，過表達MAGI2-AS3后，EdU陽性細胞數(shù)較oe-NC組顯著下降(t=1.77，P<0.01)(見圖2)。

圖2 調(diào)控肺癌細胞系PG49中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對細胞增殖的影響，DAPI(藍色)染色細胞核， FITC(綠色)標記MAGI2-AS3蛋白(800×)

三、 lncRNA MAGI2-AS3對PG49細胞凋亡的影響

細胞凋亡/壞死檢測結(jié)果顯示，過表達MAGI2-AS3后，凋亡細胞數(shù)較oe-NC組顯著增多(t=1.30，P<0.05)(見圖3)。

圖3 肺癌細胞中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對細胞凋亡的影響；標尺為50μm，(×200)

四、 lncRNA MAGI2-AS3對細胞遷移的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示過表達MAGI2-AS3后，侵襲細胞數(shù)較oe-NC組顯著下降(t=2.49，P<0.01)(圖4)。以上結(jié)果說明lncRNA MAGI2-AS3對肺癌有抑制作用。

圖4 調(diào)控肺癌細胞中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3含量對細胞遷移的影響；標尺為50μm (×400)

五、 lncRNA MAGI2-AS3在體內(nèi)抑制肺癌

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，sh-RACGAP1組瘤體積顯著小于sh-NC組；oe-MAGI2-AS3組形成的腫瘤體積明顯小于oe-NC組；說明MAGI2-AS3在體內(nèi)可以抑制肺癌的發(fā)展(sh-RACGAP1組vs.sh-NC組P<0.05；oe-MAGI2-AS3組vs.oe-NC組P<0.05)，sh-RACGAP1組瘤的重量顯著小于sh-NC組；oe-MAGI2-AS3組形成的腫瘤的重量明顯小于oe-NC組(sh-RACGAP1組vs.sh-NC組P<0.05；oe-MAGI2-AS3組vs.oe-NC組P<0.05)(見圖5)。綜上所述，在體內(nèi)過表達MAGI2-AS3或抑制RACGAP1表達，可抑制腫瘤生長。

圖5 四周后各組肺癌模型小鼠移植瘤體積大小和瘤體質(zhì)量

討 論

肺癌發(fā)病率和死亡率目前居惡性腫瘤的首位，探究新的肺癌相關(guān)基因?qū)ρ芯科浒l(fā)病機制及研發(fā)新的診斷和治療藥物有重要意義。雖然大多數(shù)肺癌與吸煙有關(guān)，但世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界25%的肺癌發(fā)生在從不吸煙的人群中[9]，與幾十年前肺癌主要是吸煙男子常患疾病形成鮮明對比的是，現(xiàn)在婦女肺癌的發(fā)病率與男子相當或高于男子，并且在世界許多地區(qū)正以驚人的速度上升。因此，僅僅是避免吸煙，并不能很好的降低肺癌的發(fā)病率，仍然需要從源頭上解決肺癌發(fā)病問題。研究表明RNA通?？梢愿鶕?jù)它們是否具有編碼蛋白質(zhì)的能力分為兩類蛋白質(zhì)編碼RNA和非編碼RNA，非編碼RNA (ncRNA) 約占所有基因組轉(zhuǎn)錄物的98%，可分為短 ncRNA(<200個核苷酸)和長 ncRNA(lncRNA，>200個核苷酸)[10]。大多數(shù)肺癌病人確診時已是晚期且出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，手術(shù)不能徹底根治，因此分子靶向藥物因其靶向、安全、方便等優(yōu)點成為研究的熱點，分子機制的研究至關(guān)重要。lncRNA可通過相互調(diào)控作用，促進或抑制腫瘤的形成、進展，并且對肺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、預后及診斷等起重要作用[11]。本研究，過表達MAGI2-AS3后，凋亡細胞數(shù)顯著增多，說明MAGI2-AS3促進肺癌細胞凋亡。據(jù)相關(guān)研究報道，MAGI2-AS3在乳腺癌組織中的表達下調(diào)，過表達MAGI2-AS3可通過靶向miR-374a/PTEN通路抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[12]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌患者血漿和血小板中MAGI2-AS3的水平明顯低于健康對照組，MAGI2-AS3水平與腫瘤轉(zhuǎn)移(TNM)分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[13]。已知，MAGI2-AS3在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，過表達MAGI2-AS3通過miR-23a-3p/PTEN軸抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲能力，與本研究中，MAGI2-AS3抑制肺癌細胞遷移和侵襲的結(jié)果相符合[14]。已知，MAGI2-AS3通常在肺癌等腫瘤中表達。本研究結(jié)果表明過表達MAGI2-AS3抑制肺癌細胞增殖。在肺癌瘤體內(nèi)模型中，過表達MAGI2-AS3，可抑制腫瘤生長，過表達MAGI2-AS3后，小鼠移植瘤組織體積與重量均明顯下降。目前研究已經(jīng)證實，RACGAP1在結(jié)直腸癌、子宮癌肉瘤、胃癌、結(jié)直腸癌和食管癌等多種惡性腫瘤呈現(xiàn)高表達[15]。在本研究中，過抑制RACGAP1表達，可抑制腫瘤生長小鼠移植瘤組織體積與重量均明顯下降。

研究報道，MAGI2抑制肝癌細胞的增殖、遷移及促進其凋亡[16]。前期研究表明，lncRNA MAGI2-AS3、Fas、FasL在神經(jīng)母細胞瘤組織和細胞系中均低表達，過表達lncRNA MAGI2-AS3引起Fas、FasL的表達上調(diào)，表明MAGI2-AS3可能通過抑制Fas/FasL信號通路，而潛在地抑制神經(jīng)母細胞瘤的生長[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達MAGI2-AS3可以抑制PG49細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡，表明MAGI2-AS3在肺癌的調(diào)控過程中起到關(guān)鍵作用。

本研究證實在肺癌細胞中，上調(diào)MAGI2-AS3可抑制肺癌細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡。MAGI2-AS3是肺癌的潛在分子靶點，為肺癌的分子靶向治療提供了潛在的研究方向。