李金芳，張書源，崔 潔，陳晴晴

（新疆第二醫(yī)學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000）

引言

甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhizauralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza Inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza Glabra L.）的干燥根和根莖。甘草是多年生草本植物[1]，其干燥的根及根莖，具有祛痰止咳、補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、清熱解毒之功效，常用于癰腫瘡毒、脾胃虛弱、咳嗽痰多，還可用于緩解其他藥物的毒性、抑制胃酸的分泌，預(yù)防胃腸道潰瘍[2-3]。甘草總黃酮可以抑制酪氨酸酶的活性從而起到抗氧化的作用，進(jìn)而對(duì)抗衰老有不錯(cuò)的療效，如今已被開發(fā)利用為綠色、高效的美容化妝產(chǎn)品中的添加劑[4]。

甘草品種較多，全世界共有29 個(gè)種以及6 個(gè)變種，其中18 個(gè)種和3 變種在我國有分布。甘草在新疆有豐富的資源，具有較高的藥用價(jià)值，目前已從甘草中分離出的化合物多達(dá)300 種[5]?！吨腥A人民共和國藥典》（2020 年版）收錄的有：脹果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat）和光果甘草（Glyeyrrhiza glabra）兩種[1，6]。本實(shí)驗(yàn)以超聲輔助提取法，研究了單因素實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，探索了提取新疆甘草黃酮的最優(yōu)條件，為新疆甘草黃酮的開發(fā)及應(yīng)用提供一定參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)，UV1802G，天津冠澤科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，N-1300，上海愛朗儀器有限公司；油浴鍋，OSB-2200，上海愛朗儀器有限公；萬分之一電子天平，LE204E，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；百分之一電子天平，YP202N，上海菁海儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；中草藥粉碎機(jī)，F(xiàn)W135，天津市泰斯特儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-700DE，昆山市超聲儀器有限公司；尼龍篩，40目（0.4 mm）。

1.2 試劑

甘草，批號(hào)：911051，新疆本草堂藥業(yè)有限公司；蘆丁，純度：HPLC≥98%，批號(hào)：1009H022，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉，AR，批號(hào)：20200320，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁，AR，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，AR，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，AR，天津永晟精細(xì)化工有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁對(duì)照品溶液制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品20 g/mg（120 ℃下干燥至恒重），置于100 mL 的容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，搖勻，備用（質(zhì)量濃度為0.200 0 mg/mL）。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次精密移取上述蘆丁對(duì)照品溶液0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL 置25 mL 量瓶中，依次進(jìn)行以下操作：

1）加入5%NaNO2溶液2.00 mL，搖勻，靜置6 min；

2）加入10% Al（NO3）3溶液2.00 mL，搖勻，靜置6 min；

3）再加入4%NaOH 溶液12.00 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min；

4）紫外可見分光光度法，在522 nm 波長處測(cè)定上述各溶液的吸光度值。

以系列蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為y=11.075x-0.005（r=0.999 6），說明蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.008 mg/mL～0.080 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

圖1 系列質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 甘草總黃酮提取率計(jì)算

甘草總黃酮提取率計(jì)算公式見式（1）：

式中：W 為甘草總黃酮提取率，%；C 為甘草總黃酮提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為甘草總黃酮提取液體積，mL；M 為甘草粉末質(zhì)量，g。

2.4 超聲輔助提取甘草總黃酮工藝研究

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)主要考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取功率對(duì)新疆甘草總黃酮提取效率的影響。

1）料液比的選擇。以不同料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 的比例進(jìn)行提取，其他條件保持不變，測(cè)定甘草黃酮的提取率。

2）提取溫度的選擇。以不同提取溫度40、50、60、70、80 ℃分別進(jìn)行提取，其他條件保持不變，測(cè)定甘草黃酮的提取率。

3）乙醇濃度的選擇。以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、80%、70%、60%、50%進(jìn)行提取，其他條件保持不變，測(cè)定甘草黃酮的提取率。

4）提取超聲功率的選擇。以不同提取超聲功率420、490、560、630、700 W 進(jìn)行提取，其他條件保持不變，測(cè)定甘草黃酮的提取率。

5）提取時(shí)間的選擇。以不同提取時(shí)間5、10、15、25、30 min 分別進(jìn)行提取，其他條件保持不變，測(cè)定甘草黃酮的提取率。

通過紫外可見分光光度法測(cè)定吸光度，以甘草總黃酮提取率為指標(biāo)，篩選出對(duì)提取率影響最顯著的因素（圖2）。

圖2 提取時(shí)間對(duì)甘草總黃酮提取率的影響

由圖2 可知：隨著提取時(shí)間的延長，提取率先上升再下降又上升，在10 min 和15 min 時(shí)甘草總黃酮的提取率較高，10 min 時(shí)的提取率略高于15 min，綜合提取率與節(jié)能考慮，故選取最佳提取時(shí)間為10 min。

由圖3 可知，隨著料液比的增大，甘草總黃酮的提取率逐漸升高，在料液比為1∶15 和1∶20 時(shí)均有較高的提取率，在料液比大于1∶20 后，黃酮的提取率下降，綜合各方面因素，選擇最佳料液比為1∶15。

圖3 料液比對(duì)甘草總黃酮提取率的影響

由圖4 可知，甘草總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)甘草總黃酮提取率最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，甘草黃酮提取率開始下降，因此，選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為70%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)甘草總黃酮提取率的影響

由圖5 可知，隨著提取溫度的升高，甘草黃酮的提取率先下降再升高，提取達(dá)到70 ℃以后提取率基本保持恒定，因此，選擇最佳的提取溫度為70 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)甘草總黃酮提取率的影響

由圖6 可知，隨超聲功率的增加，甘草總黃酮的提取率先減小再增大，當(dāng)超聲功率為630 W 時(shí)提取率最高，大于650 W 時(shí)，甘草黃酮的提取率開始下降，因此，選擇最佳超聲功率為630 W。

圖6 超聲功率對(duì)甘草總黃酮提取率的影響

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

從上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，超聲功率對(duì)甘草總黃酮的提取率影響較小，因此，選擇提取時(shí)間、料液比、提取溫度、乙醇濃度4 個(gè)因素，設(shè)計(jì)成L（34）正交實(shí)驗(yàn)（表1、表2）。

表1 水平因素設(shè)計(jì)表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的K 值與R 值可以看出，對(duì)新疆甘草總黃酮提取率影響因素的大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。通過各因素的極差R 值的比較，可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的極差較大，這說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)甘草黃酮提取率的影響比較顯著；料液比和提取時(shí)間的極差較小，說明兩個(gè)因素對(duì)甘草黃酮提取率的影響較小。

通過綜合分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了新疆甘草總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶20，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為10 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，新疆甘草總黃酮平均提取率為2.27%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用NaNO3-Al（NO3）3-NaOH 分光光度法，在波長522 nm 處測(cè)定新疆甘草中黃酮的含量，該方法操作簡單，靈敏度和準(zhǔn)確度較高，且線性關(guān)系良好。通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定正交實(shí)驗(yàn)的因素和條件，再通過平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定新疆甘草中總黃酮含量，并計(jì)算總黃酮的提取率，獲得最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶20，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為10 min。此方法的建立為新疆甘草的綜合利用提供一定依據(jù)，也為更好開發(fā)和利用新疆甘草資源提供參考。