單紅麗，李銀煳，李婕，王曉燕，張榮躍，李文鳳，黃應(yīng)昆

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開(kāi)遠(yuǎn) 661699）

0 引言

我國(guó)是世界上第三大食糖生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，甘蔗是我國(guó)重要的糖料經(jīng)濟(jì)作物，蔗糖產(chǎn)業(yè)在促進(jìn)邊疆地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民增收和鄉(xiāng)村振興中具有重要作用[1]。甘蔗褐條病和梢腐病是為害甘蔗葉部的災(zāi)害性真菌病害，廣泛分布于世界多個(gè)植蔗國(guó)家和地區(qū)，給當(dāng)?shù)卣崽钱a(chǎn)業(yè)帶來(lái)不同程度的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。近年多雨高濕加上感病品種規(guī)?；N植，導(dǎo)致甘蔗褐條病和梢腐病在云南、廣西蔗區(qū)為害成災(zāi)，損失嚴(yán)重[4-6]。多數(shù)蔗區(qū)因防治不及時(shí)、不到位，感病品種常使大量蔗莖枯死，甘蔗減產(chǎn)30%～48%，糖分降低2%～4%，經(jīng)濟(jì)損失巨大[5-7]。適時(shí)監(jiān)測(cè)病菌變異動(dòng)態(tài)、致病力差異和篩選抗病品種是病害防控的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而監(jiān)測(cè)病菌變異動(dòng)態(tài)、致病力差異、篩選抗病品種及綠色高效殺菌劑等應(yīng)用研究，均需要獲得大量的病菌分生孢子[8]。如何快速獲得足量的分生孢子成為當(dāng)前甘蔗褐條病和梢腐病理論研究和實(shí)踐工作中首要解決的問(wèn)題及技術(shù)難點(diǎn)。改進(jìn)和提高現(xiàn)有甘蔗褐條病和梢腐病病原菌產(chǎn)孢技術(shù)體系，有助于深入研究病原菌、精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)病菌變異動(dòng)態(tài)、高效篩選抗病品種，為病害防控提供基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。為此，我們針對(duì)現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)的缺陷與不足，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，篩選出甘蔗褐條病與梢腐病病原菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)方法，以滿足甘蔗褐條病和梢腐病深入研究與防控的需求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

本研究所用甘蔗褐條病菌菌株和梢腐病菌菌株均采集自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所基地，保存于云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試試劑

KH2PO4，KNO3，蔗糖，維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酰胺，泛酸鈣，維生素C，馬鈴薯，燕麥片，葡萄糖，瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

采集感染甘蔗梢腐病病葉，采用組織分離法分離病菌，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d 后挑取邊緣菌絲，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上純化獲得純化菌株。用真菌基因組DNA 提取試劑盒（上海生工生物股份有限公司）按說(shuō)明書(shū)提取菌絲DNA，用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序得到的片段在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，片段與數(shù)據(jù)庫(kù)登錄甘蔗梢腐菌菌株序列片段一致性為100%，則確定獲得菌株為甘蔗梢腐病病菌。褐條病菌分離鑒定方法同上。

1.2.2 產(chǎn)孢培養(yǎng)基制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：取馬鈴薯200 g，向其中加入適量超純水，電磁爐上加熱30 min，期間不斷攪拌，4 層紗布過(guò)濾，取濾液，向其中分別加入20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂粉，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基）：取馬鈴薯200 g，向其中加入適量超純水，電磁爐上加熱30 min，期間不斷攪拌，4層紗布過(guò)濾，取濾液，向其中加入20 g葡萄糖，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基：取30 g 燕麥片，向其中加入適量超純水，80 ℃水浴120 min，期間不斷攪拌，4層紗布過(guò)濾，取濾液，向其中加入17 g瓊脂粉，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基：在盛有100 mL超純水的容器中分別加入KH2PO41g、KNO31g、蔗糖0.5 g、維生素B1 3 mg、維生素B2 1.5 mg、維生素B6 0.2 mg、煙酰胺10 mg、泛酸鈣1mg、維生素C 100 mg，加入超純水定容至1 000 mL，混勻。

將混勻的培養(yǎng)基分裝在250 mL 三角瓶?jī)?nèi)，121 ℃，105 kPa 高壓滅菌20 min，取出冷卻至50 ℃，得產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

1.2.3 甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢條件實(shí)驗(yàn)

不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢的影響：取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，分別接種于PDA 培養(yǎng)基和甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d后測(cè)量孢子量。

不同光照處理對(duì)病原菌產(chǎn)孢的影響：取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，28 ℃下分別置于24 h連續(xù)黑暗、12 h光照12 h黑暗條件下培養(yǎng)7 d后測(cè)量孢子量。

去除菌絲處理對(duì)病原菌產(chǎn)孢的影響:取直徑4 mm 褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)至直徑5 cm 時(shí)，在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌棉簽將菌落的白色氣生菌絲除去，以未用無(wú)菌棉簽除去菌落白色氣生菌絲的培養(yǎng)皿為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后測(cè)量孢子量。

1.2.4 甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢條件實(shí)驗(yàn)

將純化培養(yǎng)的甘蔗梢腐病菌菌絲用無(wú)菌手術(shù)刀刮取后，匯集到已滅菌的梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基中，200 r/min，27±2 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d后測(cè)量孢子量。

1.2.5 產(chǎn)孢量測(cè)定

甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢量測(cè)定：在產(chǎn)孢培養(yǎng)基表面倒入適量無(wú)菌水，輕磨菌落，洗下分生孢子，用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾后在顯微鏡下計(jì)量分生孢子數(shù)。

甘蔗梢腐病菌產(chǎn)孢量測(cè)定：將甘蔗梢腐病病菌培養(yǎng)液分裝到無(wú)菌的50 mL 離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清，收集沉淀，用無(wú)菌蒸餾水重懸，即可獲得甘蔗梢腐病菌的分生孢子。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗褐條病菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)

甘蔗褐條病菌培養(yǎng)7 d后，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上能夠看見(jiàn)大量灰褐色的分生孢子堆（圖1 a），產(chǎn)孢測(cè)定發(fā)現(xiàn)有大量分生孢子（圖1 c）；在PDA 培養(yǎng)基上菌落白色絮狀菌絲（圖1 b），未發(fā)現(xiàn)分生孢子，培養(yǎng)15 d 后鏡檢觀察到少量分生孢子（圖1 d）。

圖1 甘蔗褐條病菌菌落形態(tài)及分生孢子Fig.1 Colony and conidia of sugarcane brown stripe pathogen

甘蔗褐條病菌在24 h 連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量最大，達(dá)到3×102個(gè)/mL，12 h 光照12 h 黑暗條件下則不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量?jī)H為3×101個(gè)/mL；去除菌絲處理后產(chǎn)孢量增大，達(dá)到4×102個(gè)/mL，而未用無(wú)菌棉簽處理的對(duì)照產(chǎn)孢量較少，僅為3×101個(gè)/mL。

2.2 甘蔗梢腐病菌快速大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)

甘蔗梢腐病菌在PDA 培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)所得菌落形態(tài)如圖2 a，為白色絮狀菌絲，取菌絲在梢腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)3 d 后，在10（目鏡）×40（物鏡）下顯微鏡下觀察20～40 個(gè)視野，平均每個(gè)視野可觀察到30～50 個(gè)分生孢子（圖2 b），而在PDB培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)3 d 后，平均每個(gè)視野僅可觀察到5～8 個(gè)分生孢子。

圖2 甘蔗梢腐病菌菌落形態(tài)及分生孢子Fig.2 Colony and conidia of sugarcane pokkah boeng pathogen

3 討論與結(jié)論

甘蔗褐條病病原菌屬無(wú)性菌類半知菌亞門(mén)叢梗孢目平臍孺孢屬。國(guó)內(nèi)外對(duì)甘蔗褐條病菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基多為PDA 培養(yǎng)基[8-9]，但PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)技術(shù)存在病菌生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢時(shí)間長(zhǎng)，易雜菌污染，不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢數(shù)量少等問(wèn)題，不但阻礙了甘蔗褐條病病原菌生活史和病害發(fā)生規(guī)律的研究，而且不利于開(kāi)展對(duì)抗病品種進(jìn)行鑒定篩選等相關(guān)研究工作，已成為制約甘蔗褐條病研究的瓶頸。本研究通過(guò)對(duì)褐條病菌大量產(chǎn)孢培養(yǎng)方法的研究，發(fā)現(xiàn)取直徑4 mm褐條病菌菌塊，接種于甘蔗褐條病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)至直徑5 cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌棉簽將菌落的白色氣生菌絲除去，將病原菌置于24 h 連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)7 d可獲得大量分生孢子。相比PDA 傳統(tǒng)產(chǎn)孢培養(yǎng)方法，本方法的病原菌產(chǎn)孢速率快1 倍以上，產(chǎn)孢量增加10 倍以上，有效地解決了產(chǎn)孢少、產(chǎn)孢慢的技術(shù)難題，且本方法的培養(yǎng)方法步驟簡(jiǎn)單，操作方便，污染率低，可以促進(jìn)甘蔗褐條病菌快速高效產(chǎn)孢，為甘蔗褐條病病原菌生活史、病害發(fā)生規(guī)律、篩選抗甘蔗梢腐病優(yōu)良品種和防治方法等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

甘蔗梢腐病是由多種鐮刀菌引起的一種重要的世界性甘蔗真菌病害。鐮刀菌鑒定指南[10]中通常用康乃馨葉片水瓊脂培養(yǎng)基（CLA）進(jìn)行大型分生孢子的培養(yǎng)，但是利用該培養(yǎng)基產(chǎn)孢需要近紫外燈光的誘導(dǎo)，而且有些菌產(chǎn)大型分生孢子堆的數(shù)量少，濃度達(dá)不到菌種保存和接種濃度的要求。本研究的甘蔗梢腐病產(chǎn)孢方法產(chǎn)孢量多、產(chǎn)孢速度快，有效解決了甘蔗梢腐病病菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)孢少的問(wèn)題。使用本方法培養(yǎng)3 d 即可得到大量分生孢子，在40 倍顯微鏡下每個(gè)視野30～50 個(gè)分生孢子，與PDA 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，每個(gè)視野分生孢子增加6 倍以上，培養(yǎng)時(shí)間節(jié)省4～7 d。本方法培養(yǎng)基產(chǎn)孢量顯著增加，培養(yǎng)周期縮短，有效節(jié)約了人力物力及科研工作者的大量寶貴時(shí)間，為甘蔗梢腐病病菌變異動(dòng)態(tài)、致病力差異、篩選抗病品種及綠色高效殺菌劑等應(yīng)用研究提供了技術(shù)支撐。