張旭東，劉浩昂，王志浩，蘭 凱，陳 蕊，李 凱，劉樹義，Rajiv Kumar JHA 700 西安，西安醫(yī)學院臨床醫(yī)學院中尼友好拉吉姆醫(yī)學實驗室；70077 西安，西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

胰腺癌(pancreatic cancer)發(fā)病率逐年增加，位列所有癌癥致死原因第5位，是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤。由于早期無明顯癥狀、疾病進展快及化療有效率低，患者預后極差，總體5年生存率僅有8%，又將其稱為“癌中之王”[1]。胰腺癌治療目前主要采取手術為主，并輔助放、化療的綜合治療手段，但90%的胰腺癌患者經(jīng)指南推薦的治療后效果欠佳[2]。因此，深入闡明胰腺癌的發(fā)生機制結合分子靶向干預和放化療，是提高胰腺癌療效的重要手段[3]。Smad3是重要的細胞內分子，負責將細胞質膜受體信號傳至細胞核[4-5]。Smad3作為重要的轉錄因子，是轉移生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)下游的重要靶點。在細胞增殖[6]、損傷修復[7]、纖維化[8]、癌癥發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。在肝癌后期Smad3通過誘導上皮-間質轉化促進腫瘤轉移[11]，然而Smad3在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用目前仍不清楚。

分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)可將細胞外信息傳遞至細胞核中，在生理及病理過程中發(fā)揮重要的作用。其中p38是重要的應激激酶，能對外界刺激迅速做出反應[12]。p38在體內有α、β、γ 和 δ 4種亞型，且胰腺癌細胞均表達p38的4種亞型。研究發(fā)現(xiàn)降低胰腺癌細胞中p38 α和p38 β的表達能夠抑制胰腺癌細胞的體外生長，同時發(fā)現(xiàn)p38 α能促進胰腺癌的遷移，而p38 β對胰腺癌的遷移無明顯調控作用，由此可見p38/MAPK在胰腺癌中發(fā)揮亞型特異性功能[13]。此外，胰腺癌細胞分泌外泌體被T淋巴細胞攝取后激活p38/MAPK信號通路，進而誘導內質網(wǎng)應激介導細胞凋亡，促進胰腺癌發(fā)生、發(fā)展[14]。

自噬在生物體高度保守是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要機制[15-16]，依賴溶酶體對細胞組分的降解以維持逆境條件下機體的代謝平衡。自噬異常與胰腺癌等眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[17]。早期研究表明，利用遺傳和藥理抑制自噬會導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生，增加DNA損傷和代謝功能障礙，最終抑制胰腺癌的發(fā)展[18]。此外，自噬還可以通過降解MHC-I促進胰腺癌的免疫逃避，表明自噬增加有助于胰腺癌的進展[19]。

p38/MAPK信號通路不僅對自噬具有促進和抑制的雙重性調控[20]，而且也是細胞凋亡的主要調控通路之一。胰腺癌細胞對細胞凋亡有抵抗力，從而促進其侵襲性和對常規(guī)治療方式的抵抗力[21]。因此，靶向細胞凋亡途徑是胰腺癌治療的新思路。在生物體內細胞自噬與凋亡過程存在十分復雜的相互作用關系，過度自噬會誘導細胞凋亡。本研究通過干預Smad3的表達初步探討Smad3對胰腺癌細胞Panc-1、BxPC-3自噬和凋亡的影響機制，進而初步驗證Smad3表達水平在人胰腺癌診斷和進展中的價值；同時探究Smad3對胰腺癌細胞自噬的調控能力，以期為胰腺癌的治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、標本及試劑

人的胰腺癌細胞系Panc-1、AsPC-1、BxPC-3購自美國ATCC細胞庫(American Type Culture Collection)；胰腺正常導管上皮細胞HPDE購自武漢普諾賽公司。對照和胰腺癌患者組織標本來自2015-2020年西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和咸陽人民醫(yī)院。標本獲取經(jīng)捐贈者或親屬的書面知情同意，研究獲得西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(XYL2022122)。主要試劑：胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自HyClone公司；LipofectamineTM2000購自美國英杰生命技術有限公司；總蛋白提取試劑盒、PI-Annexin-V試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；抗體Smad3、p-Smad3購自愛博泰克生物有限公司；GAPDH購自康成生物技術有限公司；p-p38、p38、LC3、p62購自美國Cell Signaling Technology公司；SB203580購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Sigma公司；DAB檢測試劑盒購自中杉金橋公司。對照組(Sh-Scramble)病毒及Smad3敲減序列(Sh-Smad3、CRISPR/Cas9-Smad3)由擎科生物公司合成，見表1。

表1 shSmad3、CRISPR/Cas9-Smad3與shScramble序列

1.2 生物信息學分析

利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http: //gepia.cancer - pku.cn/)對Smad3在胰腺正常組織(n=171)及癌組織(n=179)中的表達差異和存活相關性進行統(tǒng)計學分析。

1.3 免疫組化

將臨床標本組織切片放置60 ℃ 烘箱烘片1 h，將切片放入環(huán)保透明劑中脫蠟2次，每次20 min。之后依次放入100%、95%、70%、50%乙醇中各水化5 min，去離子水中浸泡5～10 min后置于10 mmol/L pH 6.0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中抗原修復3.5 min，室溫自然冷卻。PBS中浸泡5～10 min，3% H2O2室溫放置10 min，0.1% TX-100室溫孵育10 min，PBS洗2～3次，每次5 min，3% BSA室溫封閉1 h。一抗Smad3(1∶500)溶于 1% BSA，4 ℃ 過夜。1×PBS 洗4次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h。PBS 洗4次，每次5 min，DAB顯色后，蘇木精復染3～5 min后自來水充分沖洗顯色。1% HCl(75% 乙醇中)水化5 s，自來水沖洗3～5 min，95%、100%乙醇各脫水5 min，最后用中性樹膠封片保存。

1.4 細胞培養(yǎng)及分組

胰腺癌細胞株Panc-1、BxPC-3生長于37 ℃、5% CO2以及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。細胞培養(yǎng)使用含10% FBS、1%雙抗(鏈霉素、青霉素)的完全培養(yǎng)基，2 d進行一次傳代。敲減實驗分為對照組(Scr)和Smad3敲減組(ShSmad3-1、ShSmad3-2組：細胞分別轉染ShSmad3-1、ShSmad3-2慢病毒)；敲除實驗分為空白對照組(WT)和Smad3敲除組(Smad3 KO-1、Smad3 KO-2組：Panc-1細胞分別轉入CRISPR/Cas9-Smad3質粒，經(jīng)嘌呤霉素篩選后的單克隆細胞系1#、2#)?；貜蛯嶒炘谇脺p實驗3組基礎上再加入25、50 μmol/L羥氯喹(HCQ)；過表達實驗在敲減實驗3組基礎上再加入外源過表達Smad3(pLVX- Smad3)；抑制實驗在敲減實驗3組基礎上再加入p38抑制劑SB203580 20 μmol/L(SB203580)。處理細胞48 h后，收集各組細胞進行相關檢測。

1.5 病毒包裝

當293T細胞生長至60%～70%時進行轉染。將PMD2.G、PSPAX2、pLKO.1 sh-Smad3 按1∶1∶1各8 μg及60 μL轉染試劑PEI加入750 μL DMEM培養(yǎng)基(不含血清、雙抗)，混合均勻，室溫放置20 min后加入293T細胞轉染4～6 h，換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h可收集培養(yǎng)基上清，1 500×g離心10 min，取上清，再用0.45 μm 濾膜過濾，所得液體即為包裝后病毒。

1.6 慢病毒感染

BxPC-3細胞在6孔板中長到融合度為50%～60%時，按培養(yǎng)基與病毒液體積比1∶1進行加液，同時加入1 μL (2 000×) polybrene混勻。2 d后，加入1.5 μg/mL嘌呤霉素篩選2 d，收樣進行檢測。

1.7 CRISPR/Cas9、ShSmad3質粒構建及CRISPR/Cas9-Smad3敲除細胞的篩選

將合成的gRNA及ShRNA正義鏈與反義鏈進行退火，退火產(chǎn)物與經(jīng)過雙酶切的pLKO.1(EcoRⅠ、AgeⅠ)、PX459(BbsⅠ)載體進行連接，小提質粒，并經(jīng)測序驗證。

將構建好的針對Smad3基因的CRISPR/Cas9敲除質粒純化后轉入胰腺癌細胞(Panc-1)中。經(jīng)過穩(wěn)定篩選挑單克隆，并通過提取基因組DNA和Western blot確定其表達情況。經(jīng)過鑒定篩選2個獨立的細胞系用于后續(xù)實驗。基因組PCR上游引物序列：5′-GCCTTC-AATATGAAGAAGGAC-3′，下游引物序列：5′-CATTCG-GGTCAACTGGTA-3′。

1.8 細胞計數(shù)

將生長良好的105個細胞鋪在6孔板上，分別在生長0、3、5 d用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并用結晶紫進行染色。

1.9 蛋白提取及Western blot 檢測

收好的細胞加入含有蛋白酶抑制劑的裂解溶液Lysis Buffer (DTT、mG132、Cocktail、DTT、PhosSTOP)置于冰上，每隔5 min劇烈渦旋1次，共裂解20 min后，12 500×g、4 ℃離心5 min，取上清進行BCA蛋白定量，加入對應體積的蛋白上樣緩沖液(5×Loading buffer)，95 ℃加熱 5 min后進行蛋白電泳。10% SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜(使用前用甲醇浸泡激活30 s)，用含5%脫脂奶粉的PBST搖床封閉1 h。加入一抗p-p38、p38、LC3、p62(1∶1 000)、Smad、p-Smad3(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜4次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，PBST洗膜4次，每次5 min，用ECL法發(fā)光后膠片曝光。

1.10 PI-Annexin V染色

BxPC3、Panc-1胰腺癌細胞用PBS洗滌2次，用不含EDTA的胰酶進行完全消化，1 000×g離心5 min，棄上清收集細胞，并用PBS輕輕重懸細胞計數(shù)，然后再1 000×g離心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液(PI)，然后在室溫下避光孵育15 min，最后通過流式細胞儀檢測分析。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Smad3蛋白表達與胰腺癌的關系

GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，與正常胰腺組織相比，Smad3在胰腺癌組織中高表達(P<0.05，圖1A)，同時在胰腺癌不同分期Smad3的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003 22，圖1B)。進一步將胰腺癌患者分為Smad3高表達組(n=45)和Smad3低表達組(n=45)，通過生存分析發(fā)現(xiàn)Smad3的表達與胰腺癌患者的生存率呈負相關(P=0.006 1，圖1C)。利用臨床病理標本進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)Smad3在胰腺癌組織中高表達(圖1D)。

A：GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析胰腺癌組織與正常組織中Smad3的表達 a：P<0.05；B：GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析胰腺癌不同分期中Smad3的表達差異；C：Smad3表達與患者生存的相關性；D：免疫組化檢測Smad3在胰腺病理切片中的表達

2.2 胰腺癌細胞系中Smad3的表達

收集胰腺正常導管上皮細胞HPDE、胰腺癌細胞BxPC-3、AsPC-1、Panc-1。通過Western blot檢測Smad3的表達情況。與胰腺正常導管上皮細胞相比，Smad3在胰腺癌細胞BxPC-3、Panc-1中表達較高(圖2)。因此，后續(xù)實驗選擇這2個細胞系進行。

A：Western blot檢測Smad3的表達；B：半定量分析 a：P<0.05，與HPDE比較；b：P<0.05，與AsPC -1比較

2.3 胰腺癌細胞系BxPC-3、Panc-1中敲除(敲減)Smad3

分別利用ShRNA以及CRISPR/Cas9兩種不同的體系干預Smad3的表達。BxPC-3細胞中轉入ShSmad3-1、ShSmad3-2慢病毒72 h后，qPCR檢測結果顯示Smad3 mRNA水平下調明顯(P<0.05，圖3A)，同時利用Western blot從蛋白水平進行驗證，發(fā)現(xiàn)2個ShRNA的敲減效果較好(圖3B)。進一步在Panc-1細胞中轉入CRISPR/Cas9-Smad3質粒經(jīng)嘌呤霉素篩選后挑取單克隆。利用Western blot和測序進行驗證，發(fā)現(xiàn)單克隆細胞系1#、2#敲除較好(圖3C、D)，可以用于后續(xù)實驗。

Scr：對照組；ShSmad3-1、ShSmad3-2：Smad3敲減組；a：P<0.05，與對照組(Scr)比較

WT：空白對照組；Smad3-KO：Smad3敲除組；M：標準

2.4 在胰腺癌細胞中敲減Smad3影響細胞凋亡

利用構建好的Smad3敲減BxPC-3穩(wěn)轉細胞系鋪板(105個細胞)繪制細胞的生長曲線(圖4A)，并進行結晶紫染色(圖4B)。敲減Smad3后，胰腺癌細胞BxPC-3、Panc-1的數(shù)目均顯著減少。同時利用Smad3敲減的Panc-1、BxPC-3細胞進行PI-Annexin V標記并進行流式分析，發(fā)現(xiàn)敲減Smad3后凋亡細胞顯著增加(P<0.05，圖4C)，提示Smad3對胰腺癌的發(fā)生發(fā)展至關重要。

A：敲減Smad3后各組胰腺癌細胞計數(shù)分析 a：P<0.05，與對照組(Scr)比較；B：結晶紫染色觀察敲減Smad3后各組胰腺癌細胞生長情況；C：流式細胞儀檢測敲減Smad3后胰腺癌細胞的凋亡情況

2.5 敲除(敲減)Smad3后自噬蛋白LC3、p62蛋白水平降低

在敲除、敲減Smad3的Panc-1細胞中，LC3、p62均顯著下調(圖5A、B)。同時在BxPC-3細胞中利用shRNA敲減Smad3后加入25、50 μmol/L羥氯喹(HCQ)，利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LC3、p62蛋白水平能回復(圖5C)。進一步說明降低Smad3的表達影響胰腺癌細胞的自噬過程。

WT：空白對照組；Scr：對照組；Smad3 KO-1、Smad3 KO-2：Smad3敲除組；ShSmad3-1、ShSmad3-2：Smad3敲減組；a：P<0.01，與對照組比較；b：P<0.01，與Smad3敲減組比較

2.6 敲除(敲減)Smad3后通過p38/MAPK通路影響細胞凋亡

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，在敲減Smad3的BxPC-3細胞中p-p38顯著上調(P<0.05，圖6A)，同時在敲除Smad3的胰腺癌細胞中p-p38蛋白水平也升高(P<0.05，圖6B)。為了進一步證明Smad3通過p38通路調控自噬誘導細胞凋亡進行了回補實驗。外源過表達Smad3后發(fā)現(xiàn)LC3、p62蛋白水平能夠回復(P<0.01，圖6C)，同時利用p38抑制劑SB203580處理胰腺癌細胞同樣發(fā)現(xiàn)LC3、p62蛋白水平增加(P<0.01，圖6D)。提示下調Smad3后胰腺癌細胞生物學過程的改變，很有可能是通過p38/MAPK信號通路。

a：P<0.05，與對照組(Scr)比較；b：P<0.01，與Smad3敲減組比較

a：P<0.05，與對照組(Scr)比較；b：P<0.01，與Smad3敲減組比較

3 討論

胰腺癌是一種惡性消化道腫瘤。由于早期沒有特別有效的診斷標志物，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就已進入中晚期，5年存活率極低。因此，相關的靶向治療研究亟待開展[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)Smad3在胰腺癌中高表達且與患者的生存呈負相關，同時敲減Smad3后導致胰腺癌細胞凋亡增加。結果提示Smad3對胰腺癌發(fā)生、發(fā)展有重要的調控作用。研究表明植物類黃酮化合物影響TGF-β1/Smad3和TGF-β1/p38 MAPK信號通路調控自噬，可以減輕肝臟纖維化[24-25]，同時發(fā)現(xiàn)Smad3能促進自噬失調調控細胞溶酶體缺失[26]，然而Smad3在胰腺癌中調控自噬與凋亡的機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)干擾Smad3通過激活p38/MAPK信號通路誘導細胞過度自噬，從而導致其凋亡增加。

自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的關鍵機制，也是一種高度保守的生物學過程。通過對自身蛋白質和細胞器的降解使細胞能夠在極端環(huán)境下存活[27]。因此，自噬調控受阻將會導致許多疾病的發(fā)生[28]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)自噬蛋白Beclin 1基因在小鼠和人體中具有腫瘤抑制作用，進一步說明自噬具有腫瘤抑制功能[29]。由于自噬在腫瘤的形成過程中具有雙重作用，因此抑制或誘導自噬途徑對腫瘤的預防和治療具有很大優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)Smad3能夠增加自噬相關蛋白LC3、p62的表達，具有自噬抑制作用，進而促進胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，針對Smad3的靶向研究將為胰腺癌治療提供新的思路。

細胞自噬與凋亡存在復雜的作用關系。自噬是細胞凋亡所需的過程，然而過度自噬能夠誘導細胞凋亡[30]。p38/MAPK是調控細胞自噬及凋亡過程的重要信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)干預Smad3的表達，p-p38蛋白水平顯著增加，而自噬蛋白LC3、p62下調，同時胰腺癌細胞凋亡也顯著增加。結果提示靶向干預Smad3后，導致胰腺癌細胞過度自噬，進而誘導胰腺癌細胞凋亡。用p38抑制劑SB203580處理Smad3敲減胰腺癌細胞相關蛋白的變化又能回復，進一步提示可能通過p38/MAPK信號通路進行調節(jié)。

綜上所述，本研究探討了Smad3表達水平與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展以及患者生存的關系，結果表明Smad3高表達與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展正相關，與患者生存負相關。此外，Smad3在胰腺癌細胞系中高表達，敲減(敲除)Smad3可明顯促進胰腺癌細胞凋亡，且能上調p-p38蛋白的表達，同時下調LC3、p62的表達。提示Smad3在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的促進作用，為臨床治療胰腺癌提供新的靶點。Smad3可作為胰腺癌一個潛在的臨床診療的生物標記物。