劉 可，劉智勇，陳旭飛，王柔芝，王 丹 400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第一附屬醫(yī)院：婦產(chǎn)科，檢驗科

嬰兒喂養(yǎng)首選母乳，當親母母乳不能成為新生兒喂養(yǎng)的第一選擇時，世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦選擇來自健康的產(chǎn)婦或人乳庫(human milk bank)的捐贈人乳(donor human milk,DHM)[1]。人乳庫是收集DHM，并負責人乳消毒、加工、檢測、儲存、分配使用等的專業(yè)機構。建立人乳庫是收集DHM的重要方式，可使母乳缺失或母乳不足的新生兒能獲得母乳喂養(yǎng)。自1909年奧地利建立首家人乳庫以來，全球已建立600余家人乳庫[2]，截止2019年我國大陸地區(qū)共建立19家人乳庫[3]。

人乳是一種生物產(chǎn)品，從采集、儲存、加工到食用的過程中出現(xiàn)污染很常見，DHM的分享存在病毒或病原體傳播的風險。中國大陸地區(qū)人乳庫運行質(zhì)量與安全管理專家的建議中提出巴氏消毒是DHM質(zhì)量的關鍵風險控制點[4]。微生物學檢測可對DHM巴氏消毒效果進行驗證及篩選，人乳庫環(huán)境感染控制可保障DHM滅菌條件[5]。2020年7月中國營養(yǎng)學會發(fā)布了醫(yī)療機構人乳庫建立與管理規(guī)范團體標準[6]，但目前各地人乳庫DHM微生物學檢測方法及環(huán)境感控效果檢測尚無統(tǒng)一規(guī)范，DHM病原學譜分析及人乳庫環(huán)境衛(wèi)生相關研究較為缺乏。因此，本研究回顧性分析我院人乳庫DHM的微生物學檢測結(jié)果及環(huán)境衛(wèi)生學監(jiān)測結(jié)果，探討采用液體增菌培養(yǎng)方法對DHM進行微生物學檢測，并對人乳庫進行環(huán)境感控監(jiān)測，以期有效預防、消除DHM的潛在風險，為人乳庫運行質(zhì)量安全管理、風險控制措施提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月至2021年12月在陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院人乳庫捐贈的1 601例DHM，均為本院住院分娩的健康產(chǎn)婦無償捐贈，并簽署捐乳知情同意書。納入標準：①捐贈資格符合《2013年北美母乳庫建立和運行管理指南》及T/CNSS 2020-003《醫(yī)療機構人乳庫建立與管理規(guī)范》中捐贈篩查要求；②冷凍儲存不超過3個月，冷藏儲存不超過24 h;③捐贈乳儲存環(huán)境符合要求：獨立區(qū)域放置且冷藏儲存溫度為4 ℃，冷凍儲存溫度為-20 ℃。排除標準： ①儲奶容器有破損或可疑污染；②外觀可見異物或性狀異常。本研究已獲得陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準[(B)KY202239]。

1.2 方法

1.2.1 微生物學檢測方法 采用液體增菌培養(yǎng)法進行DHM微生物學檢測，培養(yǎng)皿使用血培養(yǎng)瓶。隨機抽取同一捐贈者的同一批次DHM，全部混裝后用無菌注射器抽吸乳汁樣本，分別注入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶及需氧培養(yǎng)瓶各8～10 mL進行孵育。培養(yǎng)基采用Thermo Scientific液體微生物培養(yǎng)基，35～37 ℃孵育120 h，檢測儀器使用Thermo ScientificTM、 VersaTREKTM528、VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)及VITEKMS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對標本進行菌種鑒定。參照全國臨床微生物檢驗操作標準流程進行采樣及細菌的分離培養(yǎng)，藥敏標準參照美國抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準(CISIM-100)。

1.2.2 環(huán)境衛(wèi)生學檢測方法 醫(yī)院感控專職人員每月對人乳庫進行環(huán)境衛(wèi)生學檢測，檢測項目包括室內(nèi)空氣、物體表面、人乳庫工作人員手、咽拭子共4項。①空氣采樣：消毒或規(guī)定通風換氣后且無人走動的情況下靜止10 min采樣，采樣高度距離地面0.8～1.5 m，放在采樣位置暴露5 min，采樣完成后標記培養(yǎng)區(qū)域及時送檢；②物體表面：用5 cm×5 cm滅菌規(guī)格板放在被檢物體表面，用浸有無菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液棉拭子在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返各涂5次，連續(xù)采樣1～4個規(guī)格板面積，將棉拭子放入裝有10 mL無菌檢驗用洗脫液的試管內(nèi)送檢；③工作人員手：人乳庫工作人員進行衛(wèi)生手消毒后，用浸有無菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液棉拭子在手指曲面從指根到指端來回涂擦各2次，一只手涂擦面積約30 cm2，將棉拭子放入10 mL采樣液試管內(nèi)及時送檢；④咽拭子：選擇人乳庫工作人員，使其暴露喉嚨，無菌拭子輕柔迅速擦拭雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁3次，將拭子垂直放入試管內(nèi)，避免擦拭瓶口，及時送檢。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有原始數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)整理與分析，描述性統(tǒng)計方法，分類數(shù)據(jù)采用例數(shù)和百分率n(%)，兩組間分類資料比較采用卡方檢驗，不同年份間分類資料間分布采用卡方趨勢檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DHM微生物學檢測結(jié)果

2.1.1 消毒前DHM病原體分布情況 共送檢1 601例DHM樣本，巴氏消毒前組共866例。消毒前DHM樣本共培養(yǎng)出病原體644株，占比74.36%，無病原體生長222例，占比25.64%。檢出革蘭陽性菌334株，占比51.86%,革蘭陰性菌235株，占比36.49%，疑似污染73例，占比11.34%，真菌2株，占比0.31%。共檢出兩種厭氧菌：產(chǎn)氣莢膜梭菌(3株)、第三梭菌(1株)，菌種分布見表1。消毒前DHM樣本病原體檢出株數(shù)最多的前10位中，前3位分別是表皮葡萄球菌(89株)、鮑曼不動桿菌(59株)、金黃色葡萄球菌(18株)，病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況見圖1。

表1 消毒前DHM菌種分布情況及構成比 (n=644)

圖1 消毒前DHM病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況

2.1.2 消毒后DHM病原體分布情況 巴氏消毒后組共735例DHM樣本，培養(yǎng)出病原體92株，占比12.52%，無病原體生長643例，占比87.48%。檢出病原體中革蘭陽性菌59株，占比64.13%,革蘭陰性菌33株，占比35.87%。消毒后DHM樣本檢出兩種厭氧菌：產(chǎn)氣莢膜梭菌(1株)、第三梭菌(1株)，菌種分布見表2。病原體檢出株數(shù)最多的前10位中，前3位分別是蠟樣芽孢桿菌(23株)、芽孢桿菌屬(12株)、表皮葡萄球菌(7株)，檢出病原體株數(shù)前10位統(tǒng)計情況見圖2。

圖2 消毒后DHM病原體檢出株數(shù)前10位統(tǒng)計情況

表2 消毒后DHM菌種分布情況及構成比 (n=92)

2.1.3 DHM消毒前后微生物學檢測結(jié)果對比 巴氏消毒后的病原體檢出率明顯低于巴氏消毒前，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=612.283，P<0.01)。消毒后致病菌檢出率降低，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=418.154，P<0.01)，見表3。

表3 DHM消毒前后微生物學檢測結(jié)果對比 [n(%)]

2.2 環(huán)境衛(wèi)生學檢測結(jié)果

2015-2021年人乳庫空氣、物體表面、工作人員手、咽拭子進行Ⅱ類環(huán)境監(jiān)測，檢測結(jié)果經(jīng)過卡方趨勢檢驗，人乳庫空氣合格率顯著提升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，物體表面、工作人員手檢測、工作人員咽拭子檢測合格率逐年遞增，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 人乳庫Ⅱ類環(huán)境衛(wèi)生學檢測結(jié)果

3 討論

3.1 巴氏消毒是保證DHM質(zhì)量安全的關鍵環(huán)節(jié)

母乳并非無菌，研究表明采集人乳中，>75%的人乳樣本有細菌生長[7]。本次調(diào)查結(jié)果顯示，74.36%的DHM在巴氏消毒前存在病原體。檢出的病原體中75.8%為致病菌，檢出菌株數(shù)的前三位中包括鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌兩種致病菌。鮑曼不動桿菌是臨床最重要的致病菌之一，可引起醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、腹腔感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染、皮膚軟組織感染等[8]。若喂養(yǎng)污染的DHM可能導致新生兒敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎等不良后果，尤其對早產(chǎn)兒及低體重出生兒危害更大。疑因喂養(yǎng)污染采集母乳引起的新生兒敗血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎的病例報道并非少見[9-10]。本次調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)巴氏消毒后DHM病原體檢出率明顯降低，且消毒后檢出的病原體中，致病菌檢出率降低。因此，對DHM進行巴氏消毒，有效消滅人乳中本身存在或加工處理過程中可能污染的細菌，是保證DHM質(zhì)量安全的關鍵環(huán)節(jié)。

3.2 采用嚴格的微生物學檢測方法，提高DHM病原體檢出率是關鍵控制點

采用液體增菌培養(yǎng)法對DHM進行嚴格的微生物學檢測篩選，可提高病原體檢出率，有利于監(jiān)控巴氏消毒效果，篩選出不合格DHM進行丟棄銷毀。本次調(diào)查中12.5%的DHM因消毒后仍存在細菌而被丟棄。澳大利亞Perron Rotary Express人乳庫4年間數(shù)據(jù)顯示，有26%的巴氏消毒人乳因嚴格微生物學檢測篩選被丟棄[11]。本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)DHM中檢出了金黃色葡萄球菌及坂崎腸桿菌，食品安全國家標準微生物檢驗技術[12-14]中對于該類細菌均推薦進行增菌培養(yǎng)。同時，延長細菌培養(yǎng)時間，可降低假陰性風險。本次調(diào)查檢出細菌中包括苛養(yǎng)菌諾卡菌屬，此類細菌生長速度緩慢，一般5～7 d可見菌落，所需培養(yǎng)時間較長[15]。并且對DHM樣本同時進行需氧和厭氧培養(yǎng)，可以提高厭氧菌檢出率。本次調(diào)查中DHM檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌和第三梭菌兩種厭氧菌，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌是人類氣性壞疽的主要細菌，所致疾病包括氣性壞疽、食物中毒，引起壞死性結(jié)腸炎等嚴重后果。該菌需在厭氧環(huán)境進行培養(yǎng)，可形成芽孢，能耐受100 ℃、30 min的加熱[16]，無法通過巴氏消毒完全殺滅。本次調(diào)查結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的DHM樣本消毒前后的微生物檢測結(jié)果中，需氧培養(yǎng)基結(jié)果均為陰性，而厭氧培養(yǎng)基結(jié)果為陽性，我院檢驗科立即報危急值，人乳庫啟動追溯及召回程序，對DHM緊急溯源、召回，人乳庫封庫采樣后終末消毒，未造成不良后果。因此，對DHM進行嚴格的微生物學檢測，使用液體增菌培養(yǎng)，延長培養(yǎng)時間，需氧和厭氧培養(yǎng)同時進行，嚴格病原體篩選，是控制DHM質(zhì)量的最后環(huán)節(jié)，可預防及消除DHM安全危害，是保證DHM質(zhì)量安全的關鍵控制點。

3.3 加強環(huán)境清潔消毒，提高人乳庫環(huán)境衛(wèi)生檢測合格率，是確保人乳庫運行安全的關鍵風險控制點

對DHM的處理區(qū)域進行清潔和消毒的過程及評價應依照醫(yī)療機構環(huán)境表面清潔與消毒管理規(guī)范和醫(yī)院感染預防與評價規(guī)范執(zhí)行[6]。2019年我院人乳庫改為使用醫(yī)用等離子體空氣消毒器每日進行2次空氣循環(huán)消毒，環(huán)境衛(wèi)生學檢測結(jié)果顯示自2019年起人乳庫空氣培養(yǎng)合格率顯著提高。2020年我院人乳庫參照我國最新頒布的人乳庫團體標準對操作區(qū)域物體表面、超凈臺、冰箱、巴氏消毒水浴箱等儀器設備校準和消毒方式以及人乳庫操作人員工作規(guī)范進行了調(diào)整和細化，環(huán)境衛(wèi)生學檢測結(jié)果顯示，2020年起，我院人乳庫物體表面和操作人員手衛(wèi)生及咽拭子檢測合格率均逐年上升。規(guī)范人乳庫環(huán)境清潔與消毒，按照Ⅱ類環(huán)境進行環(huán)境衛(wèi)生學監(jiān)測，是保障DHM在加工、消毒、儲存和分裝等環(huán)節(jié)的質(zhì)量安全的關鍵控制點。

3.4 研究局限及結(jié)論

本研究的不足之處在于，只對DHM微生物檢測實驗方法進行了探討，未觀測DHM微生物檢測時機及采樣方式是否對檢測結(jié)果及DHM質(zhì)量造成影響。例如DHM微生物檢測是采用隨機抽樣混裝后采樣，還是全批次混裝后采樣進行檢測，仍需進一步探索。

綜上所述，本研究表明：對DHM進行嚴格的微生物學檢測，加強人乳庫環(huán)境衛(wèi)生學監(jiān)測可以提高DHM質(zhì)量，有效預防、消除DHM安全危害。我國人乳庫發(fā)展建設正處于起步階段，也是快速發(fā)展階段，對潛在危害因素進行風險評估，確定控制措施，才能切實保障人乳庫運行質(zhì)量，保證提供更安全優(yōu)質(zhì)的DHM，推動人乳庫可持續(xù)發(fā)展，使新生兒受益。