呂秀瑋，張 翼，匡繼林 00088 北京，火箭軍特色醫(yī)學中心中醫(yī)科； 40005 長沙，湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科

輸卵管是精子、卵子結合及胚胎形成、早期發(fā)育的關鍵場所，輸卵管的通暢及功能正常是成功自然妊娠的必要條件。盆腔的各種急慢性炎癥、子宮內(nèi)膜異位癥及盆腔手術后粘連均可引起輸卵管性不孕(tubal factor infertility，TFI)，其發(fā)病率占女性不孕癥的30%～50%[1]。TFI治療方法主要包括抗生素控制感染及腹腔鏡下輸卵管成形術，但存在抗生素耐藥及輸卵管通而不暢、再阻塞等副作用[2]。

通管丸是湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院婦科經(jīng)驗方，方中穿破石行氣導滯、活血化瘀，為君藥；當歸、丹參、赤芍、茺蔚子、王不留行、乳香、沒藥、澤蘭活血調經(jīng)，氣順血和，絡脈自通，香附、薤白行氣，以助行血，三七化瘀，共為臣藥；黨參、白術健脾益氣，使活血不傷正，為佐藥；路路通引經(jīng)，甘草調和諸藥，為使藥。諸藥配伍，行氣化瘀，通經(jīng)活絡，使輸卵管復通。本研究團隊在長期臨床工作中發(fā)現(xiàn)通管丸對輸卵管性不孕療效確切[3-4]，可以改善輸卵管炎癥，提高患者的受孕率[5]；通管丸中成分多樣，靶點豐富，作用通路廣泛，找出通管丸治療輸卵管性不孕的有效靶點基因、靶點蛋白、作用通路可為中醫(yī)藥治療不孕癥提供理論依據(jù)，并為下階段藥物研發(fā)做鋪墊。本研究采用生物信息學聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學探討通管丸治療輸卵管性不孕的關鍵基因和發(fā)病機制，并使用分子對接法佐以認證，以期為輸卵管性不孕的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫

本研究使用數(shù)據(jù)庫包括GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)、RefSeqGene數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/rsg)、Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/index.php)、HERB數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissADME數(shù)據(jù)庫(http://www.swissadme.ch/index.php)、Targetnet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com/calcnet/index/)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)、string數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)、PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)。本研究使用軟件包括R軟件(R x64 3.6.2R)、Perl軟件(strawberry-perl-5.30.0.1)、Cytoscape軟件(Cytoscape_v3.8.0)、ChemBio3D軟件(ChemBio3D Ultra 14.0.0.117)、Pymol軟件(PyMOL-2.4.0)、AutoDockTools軟件(AutoDockTools-1.5.7)。

1.2 方法

1.2.1 輸卵管性不孕差異基因分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫搜索輸卵管性不孕基因表達譜，檢索“Tubal factor infertility”樣本，選擇“Homo sapiens”為樣本，獲取芯片表達數(shù)據(jù)集，下載GSE及GPL文件。將數(shù)據(jù)導入R軟件中，使用Limma包以設定調整后P值(adjustPValue)<0.05，表達變化幅度≥2倍(|log2 FC|≥1.0)為篩選差異基因的標準選出差異基因，并繪制差異基因火山圖，使用pheatmap繪制差異基因熱圖。

1.2.2 輸卵管性不孕疾病靶點獲取 以“Tubal factor infertility”為關鍵詞在OMIM數(shù)據(jù)庫、RefSeqGene數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫中查找輸卵管性不孕表達的基因，將3種數(shù)據(jù)庫及GEO數(shù)據(jù)庫獲得疾病基因，重復基因靶點保留1個，所得即為疾病靶標，并使用R軟件中的“vene”包繪制疾病靶標韋恩圖。

1.2.3 通管丸有效成分篩選及靶點預測 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取黨參、白術、當歸、赤芍、丹參、澤蘭、香附、乳香、沒藥、王不留行、薤白、茺蔚子、甘草、路路通、三七所含有的化合物，依據(jù)藥物口服利用度≥30%及類藥性≥0.18分別篩選出有效活性成分；收集TCMSP數(shù)據(jù)庫中各有效活性成分的靶點蛋白及基因；因TCMSP中無穿破石、茺蔚子對應的有效成分及靶點，利用HERB數(shù)據(jù)庫搜索穿破石、茺蔚子成分，根據(jù)成分名(Ingredient name)通過PubChem數(shù)據(jù)庫找出成分SMILE式；使用SMILE式搜索SwissADME數(shù)據(jù)庫，以“GL absorption：high，Druglikeness-Bioavailability Score>0.18”為標準篩選穿破石、茺蔚子有效成分；利用穿破石、茺蔚子有效成分的SMILE式通過Targetnet數(shù)據(jù)庫查詢穿破石成分對應靶點(選定Prog=1.0)。

利用Uniprot數(shù)據(jù)庫以“Homo sapiens(人屬)”為關鍵詞進行藥物靶點id轉換，將藥物有效活性成分的靶點全稱轉換為基因符號(gene symbol)，匯總建立中藥-成分-靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2.4 中藥-成分-基因網(wǎng)絡圖繪制 使用R軟件中的“vene”包將藥物基因及疾病基因取交集，為通管丸治療TFI的潛在作用基因，使用perl語言整理交集基因network、type文件，使用Cytoscape進行可視化處理，繪制中藥-成分-基因網(wǎng)絡圖。

1.2.5 PPI蛋白互作網(wǎng)絡、核心網(wǎng)絡構建與拓撲分析 將1.2.4獲得的通管丸治療TFI的潛在作用基因輸入string數(shù)據(jù)庫中，其中Organism中選擇Homo sapiens，獲得PPI網(wǎng)絡；將獲取的PPI網(wǎng)絡信息導入Cytoscape中，使用CytoNCA插件進行拓撲分析，獲得核心網(wǎng)絡。

1.2.6 靶點通路分析 將1.2.4獲得的通管丸治療TFI的潛在作用基因通過R軟件中的“org.Hs.eg.db”包轉換為gene ID，將基因ID通過R軟件進行GO、KEGG分析。并根據(jù)KEGG分析結果利用Cytoscape軟件繪制靶點-通路網(wǎng)絡圖。

1.2.7 分子對接 將1.2.5所獲得的核心網(wǎng)絡的基因與其對應的藥物配體作為研究對象，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫查詢配體的2D結構，通過ChemBio3D軟件轉化為3D結果，調節(jié)其結構以達自由能最小。通過uniprot數(shù)據(jù)庫篩選核心基因對應蛋白,其中popular organisms選擇HUMAN；通過PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶蛋白3D結構，運用Pymol軟件移除核心靶蛋白的小分子配體及水分子，并使用PDB數(shù)據(jù)庫查詢核心靶蛋白對應的原始配體或抑制劑。采用AutoDockTools軟件將各靶蛋白和其對應最低結合能的藥物配體進行分子對接，運用Pymol軟件進行可視化分析。

2 結果

2.1 GEO差異基因分析

通過GEO數(shù)據(jù)庫查詢搜索輸卵管性不孕基因表達譜，獲取GSE108202芯片表達數(shù)據(jù)集及GPL21145-48548平臺文件，共有3例正常樣本(熱圖中為Type C)及3例輸卵管炎癥樣本(熱圖中為Type T)，設定調整后P值(adjustPValue)<0.05，表達變化幅度≥2倍(|log2 FC|≥1.0)為篩選差異基因的標準，選出差異基因517個，其中上調基因361個，下調基因156個，差異基因火山圖見圖1，根據(jù)P值(PValue)篩選前100位顯著性意義最大的差異表達基因繪制熱圖，見圖2?；鹕綀D中，綠色為下調基因，紅色為上調基因，黑色代表無明顯異常表達基因；熱圖中，紅色代表高表達，藍色代表低表達。

圖1 輸卵管性不孕差異表達基因火山圖

圖2 輸卵管性不孕前100位顯著性意義最大的基因熱圖

2.2 輸卵管性不孕疾病靶點獲取

從OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得輸卵管性不孕疾病基因200個；從RefSeqGene數(shù)據(jù)庫中獲得疾病基因31個；設定score>30,從GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得疾病基因41個；1.2.1中獲得GEO差異基因518個，使用R軟件的“vene”包去重復取并集后得到疾病靶點776個，制作出輸卵管性不孕疾病基因韋恩圖，見圖3。

圖3 輸卵管性不孕基因韋恩圖

2.3 通管丸有效成分篩選及靶點預測

篩選得出通管丸有效成分243種，其中白術4種，赤芍13種，茺蔚子8種，穿破石7種，當歸2種，黨參16種，丹參58種，甘草88種，路路通4種，沒藥30種，乳香5種，三七7種，王不留行4種，香附16種，薤白11種，澤蘭2種；得到通管丸有效成分對應靶點(除去重復靶點后)337個。

2.4 中藥-成分-基因網(wǎng)絡圖繪制

預測通管丸治療TFI基因33個，對應中藥成分173種，將所得結果導入Cytoscape中，繪制中藥-成分-基因網(wǎng)絡圖，見圖4。圖中方形節(jié)點為通管丸治療輸卵管性不孕的靶基因，面積代表與此靶基因相關的成分的數(shù)目，面積越大，與此靶基因相關的藥物成分越多。圖中圓形節(jié)點為藥物成分，顏色與中藥名稱對應，1號色為白術，2號色為赤芍，3號色為茺蔚子，4號色為穿破石，5號色為當歸，6號色為黨參，7號色為丹參，8號色為甘草，9號色為路路通，10號色為沒藥，11號色為乳香，12號色為三七，13號色為王不留行，14號色為香附，15號色為薤白，16號色為澤蘭。

2.5 PPI蛋白互作網(wǎng)絡、核心網(wǎng)絡構建與拓撲分析

將33個通管丸治療TFI的潛在作用基因輸入string數(shù)據(jù)庫中，其中Organism中選擇Homo sapiens，minimum required interaction score≥0.15，同時刪去游離靶基因，獲得PPI網(wǎng)絡,PPI網(wǎng)絡中存在33個節(jié)點(靶點)，762條邊(靶點間相互作用關系)。將獲取的PPI信息導入Cytoscape中，根據(jù)Betweenness>5.55，Closeness>0.82，Degree>50，Eigenvector>0.19，LAC>42.67，Network>46.21進行拓撲分析，所得網(wǎng)絡中存在14個節(jié)點，182條邊；再將獲取到的網(wǎng)絡信息導入Cytoscape中，根據(jù)Betweenness>0.78，Closeness>0.81，Degree>24，Eigenvector>0.28，LAC>22.77，Network>22.94，獲得核心網(wǎng)絡，所得網(wǎng)絡中存在7個節(jié)點，91條邊，見圖5、6。

圓圈顏色顯示通管丸相關成分

圖5 通管丸治療TFI潛在靶基因的蛋白-蛋白交互作用網(wǎng)絡圖

圖6 通管丸治療TFI的PPI核心網(wǎng)絡

2.6 靶點通路分析

將33個通管丸治療TFI的潛在作用基因通過R軟件進行GO分析及KEGG分析，共篩選得到1 581條GO條目(P<0.05)和39條KEGG通路(P<0.05)。

選取GO富集分析前10位條目繪制氣泡圖(圖7)，縱坐標代表GO名稱，圓圈面積大小代表富集在該GO上基因的數(shù)目，顏色代表富集顯著性。GO富集顯著且基因數(shù)目較多的生物學過程主要涉及上皮細胞增殖、上皮細胞增殖調節(jié)、血管生成調節(jié)、血管發(fā)育調節(jié)、酪氨酸磷酸化、內(nèi)皮細胞增殖陽性調節(jié)；主要涉及核染色質、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子、核轉錄因子復合體、囊泡腔、薄膜筏等細胞組分；主要涉及細胞因子受體結合、核受體活性等分子功能。

圖7 潛在靶基因的GO富集氣泡圖

將39條KEGG通路繪制氣泡圖(圖8)，原理同GO富集分析。由此可見靶點顯著富集于流體剪應力與動脈粥樣硬化，內(nèi)分泌抵抗，局部粘連，脂質和動脈粥樣硬化，細胞衰老，壞死，縫隙連接，酪氨酸代謝，生長激素的合成、分泌和作用，細胞凋亡，內(nèi)分泌及其他因素調節(jié)的鈣的重吸收、黏著小帶等。生物通路主要涉及HIF-1信號通路、MAPK信號通路、P13K-Akt信號通路、Ras信號通路、鈣信號通道、ErbB信號通路、IL-17信號通路、Rap1信號通路、JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路等。將KEGG結果輸入Cytoscape_v3.8.0中，繪制靶點-通路網(wǎng)絡圖(圖9)，圖中圖面積越大，連接的點越多。圖9中MAPK信號通路(hsa04010)與10個基因相聯(lián)，居通路之首，基因EGFR與18個通道相聯(lián)，居基因之首。

圖8 潛在靶基因KEGG富集氣泡圖

圖9 通管丸治療TFI的靶點-通路分析

2.7 分子對接

將核心靶點TP53、EGF、VEGFA、IL1B、JUN、EGFR、ERBB2與其對應的藥物成分進行分子對接，并采用原始配體或抑制劑作為陽性對照，以評價核心靶點蛋白與配體互相結合的能力，見表1，配體和受體結合越穩(wěn)定，所需能量越低，結合能<0 kcal/mol代表受體及配體可自發(fā)結合。通管丸治療TFI的核心靶點與其對應的成分結合的結合能均<-5 kcal/mol，提示上述成分與靶點的結合活性好。由此可知，beta-sitostero、formononetin、kaempferol、luteolin、quercetin、rhein、tanshinone iia與JUN蛋白，quercetin與EGF蛋白，luteolin、n-coumaroyltyramine、quercetin與EGFR蛋白，aloeemodin、ginsenoside rh2、quercetin與IL1B蛋白，acacetin、aloeemodin、baicalein、luteolin、quercetin、tanshinone iia與TP53蛋白，baicalein、ellagic acid、luteolin、quercetin與VEGFA蛋白相互結合所需結合能比其所對應的原始配體或抑制劑更小，存在較好的結合。而luteolin、quercetin與ERBB2蛋白結合較原始配體所需結合能更多，結合相對較差。然后選取各靶蛋白和其對應最低結合能的藥物配體進行分子對接，運用Pymol軟件進行可視化分析，如圖10。

表1 藥物有效成分與核心靶點的對接結果

A：tanshinone iia-JUN；B：quercetin-EGF；C：quercetin-EGFR；D：quercetin-ERBB2；E：ginsenoside rh2-IL1B；F：tanshinone iia-TP53；G：quercetin-VEGFA

3 討論

中醫(yī)將TFI歸于“不孕”“無子”“斷緒”范疇，本團隊認為婦人或盼子心切、肝郁氣滯、疏泄失常；或邪入胞宮；或寒凝血瘀；或熱灼血瘀，導致氣血循行子管不暢，日久致瘀，瘀血內(nèi)阻要塞，精卵不能交融則致不孕。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，顯示通管丸含有有效成分243種、對應靶點337個。甘草有效成分芒柄花素(formononetin)可誘導人輸卵管細胞合成雌激素，上調白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factre，LIF)水平，促進胚胎的運輸及植入[6-7]。丹參注射液可改善輸卵管再通術后輸卵管通暢情況[8]。此外，還有一些未被報道的有效活性成分，可作為未來研究通管丸治療輸卵管性不孕的潛在方向。

通過對預測的33個治療靶點的PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，發(fā)現(xiàn)TP53、EGF、VEGFA、IL-1B、JUN、EGFR、ERBB2是通管丸治療輸卵管性不孕的關鍵靶點。IL-1B作為白細胞介素，存在于輸卵管纖毛細胞的頂端蛋白質里，在哺乳動物中，其濃度與不孕相關[9]。EGF、EGFR、ERBB2作為表皮生長因子及受體，參與細胞增殖、凋亡及局部粘連形成。表皮生長因子(EGF)可在牛輸卵管上皮細胞中促進MARK磷酸化[10]，EGFR通路也可調節(jié)Notch信號，在輸卵管中產(chǎn)生多種纖毛[11]，調節(jié)輸卵管微環(huán)境，利于受精及胚胎存活。VEGFA作為血管生長因子的重要元件，在豬的發(fā)情周期的輸卵管均有表達，其主要分布在輸卵管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞及肌層的肌纖維和血管中，參與調節(jié)輸卵管分泌動力學和輸卵管收縮[12]。文獻搜索結果與本文GO聚類分析結果類似，但關鍵靶點在人體中發(fā)揮的作用鮮有發(fā)表，可作為探究輸卵管性不孕機制的突破口。分子對接顯示：beta-sitostero、formononetin、kaempferol、luteolin、quercetin、rhein、tanshinone iia與JUN蛋白，quercetin與EGF蛋白，luteolin、n-coumaroyltyramine、quercetin與EGFR蛋白，aloeemodin、ginsenoside rh2、quercetin與IL-1B蛋白，acacetin、aloeemodin、baicalein、luteolin、quercetin、tanshinone iia與TP53蛋白，baicalein、ellagic acid、luteolin、quercetin與VEGFA蛋白之間存在較好的結合。

根據(jù)KEGG聚類分析及靶點-通路分析顯示，通管丸治療輸卵管性不孕存在多靶點、多通路作用，其中靶點參與較多通路為MAPK信號通路(hsa04010)、HIF-1信號通路(hsa04066)、PI3K-Akt信號通路(hsa04151)、局部粘連(hsa04510)、雌激素抵抗(hsa01522)；主要包含以下幾個機制：①抑制輸卵管促炎癥因子引起的局部粘連、瘢痕：MAPK通路可激活輸卵管黏膜上皮細胞中的S100A8基因，抑制炎癥因子IL-1β[13]，參與抗菌、抗炎修復等病理過程，維持輸卵管的免疫環(huán)境。IL-6可促進巨噬細胞中的Akt磷酸化，維持巨噬細胞的存活，增強成纖維細胞的收縮活性并導致嚴重的疤痕[14]。各種衣原體可以利用各種不同但相關的細胞表面受體來進入宿主細胞，這些不同的受體可能通過G蛋白，特別是通過PI3K-Akt途徑共享一個共同的下游信號傳導過程，形成瘢痕[15]。②抑制血管平滑肌細胞鈣化，引起的胚胎運輸異常：雌海龜輸卵管內(nèi)雌激素的增加可抑制TOLL樣受體TLR2/4通路抑制的免疫反應，使精子不會作為外來物質被移除直至受精為止[16]。輸卵管上皮細胞睫狀體長度和波動頻率受到ESR1調節(jié)，輸卵管上皮細胞中ESR1信號的中斷會改變纖毛功能并損害胚胎的運輸[17]。敲除PRKACA基因可抑制血管平滑肌細胞的鈣化[18]，利于輸卵管的運輸功能。③減輕細胞凋亡對輸卵管不孕影響：排卵后卵細胞在輸卵管內(nèi)發(fā)育，應激可誘導輸卵管細胞凋亡而損害胚胎發(fā)育[19]；輸卵管上皮細胞凋亡會在TP53蛋白和bcl-2家族凋亡蛋白的參與下激活[20]，嚴重的炎癥可導致糖蛋白和粘液聚集，加速輸卵管上皮細胞凋亡，使喪失緊密連接的輸卵管上皮脫落而不利于受精[21]。

本課題組曾進行體外動物實驗顯示，通管丸可抑制輸卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型血清IL-1、EGFR的水平，改善輸卵管組織粘連、纖維組織增生等慢性損傷[22-23]，與本研究吻合，但通管丸在抑制胚胎運輸異常及控制輸卵管上皮細胞凋亡方面無相關研究，可作為下一步研究方向。

綜上所述，本研究通過生物信息學聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學、分子對接法探討通管丸治療輸卵管性不孕的機制，發(fā)現(xiàn)通管丸治療TFI基因33個，對應中藥成分173種，其中核心靶點TP53、EGF、VEGFA、IL-1B、JUN、EGFR、ERBB2可能發(fā)揮重要作用，涉及上皮細胞增殖調節(jié)、血管生成調節(jié)等過程，參與細胞因子受體結合、核受體活性等分子功能；可能通過MAPK信號通路、HIF-1信號通路、P3K-Akt信號通路、雌激素抵抗等代謝通路，在抑制輸卵管促炎癥因子引起的局部粘連、瘢痕，抑制血管平滑肌細胞鈣化引起的胚胎運輸異常及控制輸卵管上皮細胞凋亡等機制下治療輸卵管性不孕。由此可見，通管丸具有多成分、多靶點、多途徑治療疾病的特點，為TFI治療提供思路，也為中藥治療TFI提供理論基礎。