肖雅，洪莉，閔潔，湯劍明，李素廷，陳茂，黃筱雨

女性盆底功能障礙(pelvic floor dysfunction，PFD)是由于盆底支持組織薄弱而引起的一系列病癥，包括壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)、盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)、肛門失禁、下尿路感覺異常、排便功能障礙以及與盆腔器官相關(guān)的慢性疼痛綜合征等[1]。陰道分娩和衰老是PFD的重要危險(xiǎn)因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)，50%的產(chǎn)婦有不同程度的SUI和POP，且發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[2]。已有研究表明，陰道分娩可能通過損害骨盆支持組織，如肌肉、結(jié)締組織和神經(jīng)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PFD[3]。經(jīng)陰道分娩后，POP、SUI和膀胱過度活動(dòng)癥的累積發(fā)生率與盆腔肌肉力量相關(guān)[4]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)多次陰道分娩小鼠盆底肌中T 型鈣離子通道(TH)編碼基因CACNA1H特異性降低，敲除小鼠CACNA1H基因(Cacna1h-/-)后出現(xiàn)多部位肌肉萎縮和肌肉功能下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress，ERS) 激活。 ERS可能是該疾病潛在的治療靶點(diǎn)[5]。

未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)是一種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)，當(dāng)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔內(nèi)積聚時(shí)被激活，從而導(dǎo)致ERS[6]。這一機(jī)制的最終目標(biāo)是通過減少蛋白質(zhì)翻譯、增加蛋白質(zhì)降解和提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力來恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，這一過程與肌肉萎縮的調(diào)節(jié)有關(guān)，而參與UPR的各種因素也被證明促進(jìn)了肌肉萎縮[7]。同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(Herpud1)是一種54 kDa的跨膜蛋白，定位于ER膜上，是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白[8]。早期研究證明Herpud1在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)線粒體功能方面起著重要作用[9]。Herpud1的誘導(dǎo)不僅提高了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力，減輕了蛋白質(zhì)超載，還參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ER-associated degradation，ERAD)多蛋白復(fù)合物的形成，有助于穩(wěn)定復(fù)合物并促進(jìn)未折疊蛋白的有效降解，可以阻止ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡[9-10]。Herpud1在應(yīng)激條件下通過穩(wěn)定依賴于三磷酸肌醇受體(IP3R)的Ca2+信號(hào)來保護(hù)細(xì)胞免于死亡[11]。Nogalska A等[12]的研究表明Herpud1在散發(fā)性包涵體肌炎中的誘導(dǎo)可以作為一種代償機(jī)制，以改善受影響肌肉纖維的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能；敲除Herpud1的小鼠表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖負(fù)荷的不耐受，并且降低了胰島素依賴性葡萄糖攝取、GLUT4 易位至質(zhì)膜[13]，這可能與肌肉的萎縮相關(guān)。綜上，Herpud1可能通過提高骨骼肌在應(yīng)激環(huán)境下的耐受能力來保護(hù)肌纖維免受損傷，目前尚無(wú)Herpud1在PFD發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)研究。本研究旨在探討Herpud1在盆底肌萎縮模型與正常小鼠中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步探究其在PFD發(fā)病機(jī)制中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)按照武漢大學(xué)的機(jī)構(gòu)指南和規(guī)定進(jìn)行。所有涉及動(dòng)物的操作均經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)利用委員會(huì)批準(zhǔn)。野生型雌性C57BL/6J小鼠(WT組)購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，Cacna1h-/-小鼠(TH-null組)購(gòu)自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Stock 013770；Bar Harbor,ME,USA)。分別各取10只4月齡未生產(chǎn)過的兩種類型小鼠，體重20～23 g，平均(21.5±1.5) g。兩組小鼠的周齡及體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及處理 小鼠C2C12成肌細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。C2C12小鼠成肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)采用高糖(4.5 g /L) (DMEM)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(DMEM+2%馬血清，1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)4 d，NNC 55-0396(Sigma-Aldrich)干預(yù)24 h、48 h。

1.1.3 主要試劑和儀器 抗Herpud1抗體(Abcam)；免疫組化試劑盒、肌肉組織固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司)；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；蛋白上緩沖液(谷歌生物技術(shù)有限公司)；正置熒光顯微鏡(日本，Olympus)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc.)；尿動(dòng)力學(xué)檢查儀為Power lab 多導(dǎo)電生理記錄儀；微量注射泵(長(zhǎng)沙健源醫(yī)療科技有限公司，JZB-1800D 型)。

1.2 方法

1.2.1 尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 采用1.5%異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行氣體麻醉后取仰臥位固定。將小兒留置針去除針芯，注射生理鹽水排氣，丁卡因膠漿潤(rùn)滑表面后行小鼠導(dǎo)尿。導(dǎo)尿手法為:一手拿顯微鑷，鉗夾尿道外口，向上提起以繃直尿道，另一手拿留置針輕輕插入尿道，進(jìn)針約1～1.2 cm。導(dǎo)尿成功后，空針抽吸排空小鼠膀胱，連接延長(zhǎng)管及三通，三通外接測(cè)壓管和微量注射泵。管道連接成功后體內(nèi)置零，然后開啟微量注射泵向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水，泵水速度為 1 mL/h。觀察膀胱壓力變化，同時(shí)檢查小鼠有無(wú)尿液溢出，此時(shí)的壓力為膀胱漏尿點(diǎn)壓(bladder leak point pressures，BLPP)。以尿道口出現(xiàn)第1滴液體為準(zhǔn)，記錄當(dāng)時(shí)的膀胱容量和膀胱內(nèi)壓分別為最大膀胱容量(MBC)和BLPP。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn) 3 次。檢測(cè)完畢后，用碘伏消毒尿道外口。

1.2.2 盆底肌取材 采用斷椎法處死小鼠后，打開盆腔，暴露盆底，分離筋膜與脂肪組織，取盆底肛提肌組織沿中線分成兩塊，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，反復(fù)、多次用生理鹽水沖洗，一塊采用肌肉固定液固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片;另一塊快速放入-80℃冰箱中低溫保存。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 按免疫組化試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作。切片在 60℃ 加熱 30 min 抗原修復(fù)，用分級(jí)醇系脫蠟再水化，一抗按照1∶100 比例稀釋。光鏡下觀察，細(xì)胞漿或胞膜中有棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。免疫活性用積分光密度(IOD)值量化，平均密度用ImagePro Plus 6.0版本軟件通過高分辨攝取圖像信號(hào)，測(cè)定灰度值，用平均灰度值表示Herpud1蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱，平均密度=IOD/面積。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 取小鼠盆底肌組織液氮研磨后加入蛋白裂解液，充分混勻后4℃、12 000 r /min離心5 min，取上清，采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液后煮沸8 min使蛋白變性，使用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后將凝膠上分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗Herpud1抗體(1∶3 000稀釋)4℃孵育過夜，PBS漂洗3遍后，二抗室溫孵1h，再次PBS漂洗3遍。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物處理免疫反應(yīng)帶，并使用ChemiDoc成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

盆底肌肉支撐膀胱或尿道并控制膀胱頸過度活動(dòng)，盆底肌薄弱或受損可能導(dǎo)致SUI[14-15]。因此，我們檢測(cè)了野生型和盆底肌萎縮模型小鼠的尿動(dòng)力學(xué)，可用來間接評(píng)估盆底肌功能。尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示：與WT組相比，TH-null組小鼠的BLPP值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；MBC測(cè)定顯示，與WT組相比，TH-null組的MBC值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。這提示T型鈣通道敲除小鼠(TH-null)出現(xiàn)盆底肌支持功能下降。詳見表1和圖1。

注：A：MBC統(tǒng)計(jì)分析；B ：BLPP統(tǒng)計(jì)分析(****與WT組比較，P<0.0001)。

表1 兩組小鼠尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)值

2.2 兩組小鼠盆底肌中Herpud1蛋白水平表達(dá)情況

Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TH-null組小鼠較WT組Herpud1表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見下頁(yè)圖2A和2B。免疫組化結(jié)果顯示，與前期研究結(jié)果一致[14-15]，通過顯微鏡觀察可見到TH-null組肌纖維面積較WT組小鼠更細(xì)小，且TH-null組免疫化學(xué)活性也同樣明顯低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見下頁(yè)圖2C和2D。

2.3 NNC處理后Herpud1表達(dá)變化

本團(tuán)隊(duì)前期研究表明T型鈣離子通道抑制劑NNC處理以時(shí)間和濃度梯度的方式促進(jìn)C2C12細(xì)胞的肌管萎縮與凋亡[5]。具體表現(xiàn)為MYHC免疫熒光染色肌管數(shù)目變少，直徑變小，萎縮相關(guān)指標(biāo)表達(dá)增高。因此接下來，本研究中C2C12分化4 d后予以NNC處理24 h和48 h，檢測(cè)細(xì)胞Herpud1蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示NNC以時(shí)間梯度的方式抑制Herpud1的表達(dá)。見圖3。

3 討論

PFD是一組普遍且令人痛苦的疾病，它導(dǎo)致膀胱、子宮陰道穹窿和直腸異常下降，包括尿失禁、大便失禁和POP等。作為老年女性的一個(gè)主要健康問題，POP和尿失禁接受單次手術(shù)的終生風(fēng)險(xiǎn)為11.1%，并且再次手術(shù)的比例很大[16]。PFD的生理病理機(jī)制復(fù)雜，有許多危險(xiǎn)因素，其中妊娠和陰道分娩作為PFD發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病因素已經(jīng)得到了廣泛的證明[17-18]。隨著人口老齡化以及“二孩”、“三孩”政策的開放，PFD在我國(guó)的發(fā)病率必然呈增高的趨勢(shì)，因此探究PFD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于疾病的防治具有重大意義。

盆底肌在盆底支撐中起關(guān)鍵作用，肛提肌作為盆底肌肉中最大、最重要的肌群，在肌肉纖維方向承受了盆底最大的壓力[19]。妊娠時(shí)子宮因重力下移，比未妊娠時(shí)更大的力量直接作用于肛提肌等支持系統(tǒng)，肛提肌等在向下的壓力作用下而被拉伸，盆底肌肉長(zhǎng)時(shí)間過度伸展，甚至超出神經(jīng)纖維牽張極限而失去神經(jīng)支配。分娩過程中，胎頭、胎臀娩出時(shí)，盆底肌承受極限牽拉甚至出現(xiàn)撕脫，對(duì)盆底肌造成嚴(yán)重的機(jī)械損傷[20]，這種損傷可能是多次分娩相關(guān)的機(jī)械損傷引起盆底肌功能缺陷的主要因素。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究中發(fā)現(xiàn)，多次分娩后小鼠盆底肌肌纖維直徑下降，肌力減退，CACNA1H的表達(dá)特異性降低。本文首先通過模擬人體尿道置管檢測(cè)TH-null小鼠尿動(dòng)力變化，發(fā)現(xiàn)TH-null小鼠的BLPP、MVB均較WT組相比明顯降低，也進(jìn)一步證明TH-null小鼠可以做為PFD的動(dòng)物模型。與此同時(shí)，前期研究發(fā)現(xiàn)TH-null小鼠中存在ERS激活和自噬抑制，而ERS抑制劑可以減輕T通道抑制劑引起的損傷和自噬抑制從而成為可能的治療靶點(diǎn)[5]，且ERS引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而引起線粒體相關(guān)凋亡發(fā)生[21]。研究表明ERS的過度激活會(huì)介導(dǎo)骨骼肌萎縮[22]。Herpud1分子被認(rèn)為是ERS損傷中的調(diào)節(jié)分子，Herpud1在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)線粒體功能方面起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，在TH-null小鼠和NNC誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞肌管萎縮模型中，Herpud1表達(dá)水平均明顯下降(見圖2和圖3)，由此可推測(cè)CACNA1H的敲除或抑制引起的Herpud1表達(dá)下降，從而使ERS過度激活，細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡和盆底肌萎縮。

注：A.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的 Western-blot分析條帶；B.小鼠盆底肌Herpud1蛋白的Western-blot定量分析(****與WT組比較，P<0.0001)；C和D.小鼠盆底肌免疫組織化學(xué)染色和定量分析(***與WT組比較，P<0.001)。

注：A.C2C12不同處理組中Herpud1蛋白的 Western-blot分析條帶；B.C2C12不同處理組中Herpud1蛋白的 Western-blot定量分析(***與WT組比較，P<0.001)。

本研究存在一定的局限性，由于缺乏人體組織研究和基因?qū)用鎸?duì)Herpud1表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，本研究?jī)H初步證實(shí)Herpud1在盆底肌萎縮模型中表達(dá)下降，可能參與盆底肌萎縮過程，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。