張詠祀，龍 蕓，鄭祖平，張紅梅，劉小紅，曹 丹，李仕偉

(1.西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000；2.廳市共建甘薯及特色豆科作物種質創(chuàng)新與利用四川省重點實驗室，四川 南充 637000；3.山西省農業(yè)科學院玉米研究所，山西 忻州 034000)

玉米是世界上第三大禾谷類作物，僅次于水稻和小麥，也是最重要的經濟和飼料作物之一[1]。隨著全球氣候變暖，極端高溫天氣的頻繁出現(xiàn)，在局部地區(qū)高溫脅迫對玉米的生產已造成了極大危害[2-4]。在玉米的整個生育周期中，高溫都會對其發(fā)育產生影響，但對高溫最敏感的時期為開花階段，主要是高溫對花粉活力的影響，高溫會導致花粉活力下降或敗育，直接影響玉米授粉結實，造成減產和品質下降。因此，選育花粉能耐高溫脅迫的玉米品種就顯得極其重要。經過玉米育種家的不懈努力，已選育出少部分花粉能耐高溫的玉米品種，如生產上常用的玉米品種中地88，其花粉能在42 ℃高溫環(huán)境保存較長時間的活性。

不同玉米材料的花粉耐高溫脅迫的能力不同，與其基因型及其表達差異有關。因此，有必要在分子水平上了解不同溫度條件下花粉基因的差異表達，這有助于揭示玉米耐高溫脅迫的分子機理。玉米耐高溫為多基因控制的數量性狀[5-6]，到底哪些基因與該性狀有關，哪些為主效基因，哪些為微效基因，這方面的研究鮮有報道。玉米素屬細胞分裂素，在控制細胞生長和分化過程中起著重要作用，同時也與植物耐高溫脅迫相關。因此，研究不同耐高溫玉米材料玉米素生物合成相關基因在高溫脅迫條件下的差異表達具有重要意義。

轉錄組測序是克隆分析差異表達基因結構及表達的重要手段，其突出優(yōu)點是一次可分析整個基因組基因的差異表達，這在許多動植物中都有報道[7-10]?；诖?，本研究選用耐高溫脅迫的玉米品種中地88和不耐高溫的先玉335為試驗材料，通過轉錄組測序分析玉米素生物合成通路中的基因結構及差異表達情況，旨在初步認識玉米花粉耐高溫脅迫的機制，為進一步克隆利用玉米耐高溫脅迫基因奠定分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取耐高溫脅迫的中地88和不耐高溫脅迫的先玉335兩個玉米品種為試驗材料。將這兩個材料種植于常溫和溫室大棚兩個生態(tài)環(huán)境。

1.2 方 法

1.2.1玉米素合成相關基因的克隆

在玉米開花期，正午時分，大棚溫度達到42 ℃時，取大棚中兩個玉米材料的花粉，同時以常溫狀態(tài)下這兩個材料花粉為對照，液氮速凍后，提取總RNA，再經mRNA純化、反轉錄及轉錄本測序分析，以獲得玉米素合成相關的差異表達基因。

1.2.2玉米素合成相關基因的生物信息學分析

對發(fā)現(xiàn)的玉米素合成相關基因，參考文獻[11]、文獻[12]，網絡在線分析其基因序列，包括內含子數目、cDNA全長、編碼蛋白數目、常見理化性質、磷酸化修飾位點、常見功能位點、二級結構和三級結構等。

1.2.3基因差異表達及代謝通路分析

根據轉錄測序結果，分析玉米素合成相關基因在不同材料不同生態(tài)環(huán)境下的表達情況，以3次重復的平均讀段數(read count)計算基因表達量。同時，分析這些基因在玉米素生物合成代謝通路中所處的位置及其生物學作用。

2 結果與分析

2.1 克隆基因序列

通過轉錄組測序，得到在不同溫度條件下玉米素合成通路中5個基因的cDNA序列，包括細胞分裂素氧化酶5基因(Zmco5)、異戊烯基轉移酶4基因(Zmit4)、細胞分裂素氧化酶4 b基因(Zmco4b)、細胞分裂素氧化酶12基因(Zmco12)和順式玉米素葡糖糖基轉移酶1基因(Zmczg1)。進一步分析發(fā)現(xiàn)這5個基因分別位于玉米第8、7、8、2、2染色體；cDNA編碼區(qū)長度分別為1 749 bp、1 095 bp、1 605 bp、1 587 bp和1 398 bp；全長基因含有的外顯子數目分別為3、1、5、5個和1個，即Zmco5、Zmco4b、Zmco12為斷裂基因，分別含有2、4、4個內含子，而Zmit4和Zmczg1沒有內含子，其編碼區(qū)是連續(xù)的。

2.2 基因的編碼蛋白

開放閱讀框分析結果顯示，Zmco5、Zmit4、Zmco4b、Zmco12和Zmczg1基因編碼蛋白的氨基酸數目分別為582、364、534、528、465個(圖1～圖5)，各自均含有20種常見氨基酸，其中帶負電荷的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)數目分別為64、47、54、54、55個，帶正電荷(精氨酸和賴氨酸)的氨基酸數目分別為55、52、48、49、48個。

圖1 Zmco5基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco5 gene

圖2 Zmit4基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmit4 gene

圖3 Zmco4b基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.3 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco4b gene

圖4 Zmco12基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.4 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmco12 gene

圖5 Zmczg1基因編碼蛋白的氨基酸序列Fig.5 The amino acid sequence of the protein encoded by Zmczg1 gene

表1 玉米素合成相關基因編碼蛋白的理化性質Table 1 Physicochemical properties of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.3 蛋白的理化性質

基因編碼蛋白的常見理化性質分析結果如表1所示。這5個蛋白中，分子量最高的是Zmco 5蛋白，最小的是Zmit 4蛋白，總的來說，其蛋白分子量大小與其含有氨基酸的數目呈正相關。從等電點分析結果可見，除Zmit 4蛋白為顯堿性外，其余4個均顯弱酸性。通過計算其不穩(wěn)定指數發(fā)現(xiàn)，Zmco 5和Zmco 4 b蛋白在細胞中能穩(wěn)定存在，而其余3個屬不穩(wěn)定蛋白。此外，從脂肪族指數和總平均親水系數兩個參數值可看出，這5個蛋白都屬親水性蛋白。

2.4 蛋白的磷酸化修飾

編碼蛋白磷酸化修飾在線分析結果如表2所示，在這5個基因的編碼蛋白中，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸殘基是常見的磷酸化修飾位點，這3種氨基酸修飾位點合計平均每個編碼蛋白有38個，其中Zmco5基因編碼蛋白的修飾位點最多，達到58個，其次為Zmco12基因編碼蛋白，為44個，最少的是Zmit4編碼的蛋白，僅有25個。

表2 玉米素合成相關基因編碼蛋白的磷酸化修飾位點Table 2 Phosphorylation modification sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.5 蛋白的功能位點

玉米素合成相關基因編碼蛋白的功能位點分析結果見表3，這5個蛋白一共包含9種不同功能位點，其中N-豆蔻酰基化位點為5個蛋白同時含有，其余位點為部分蛋白含有，ATP/GTP-結合位點基序A(P-環(huán))、酰胺化位點與依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點相對稀少，在這5種蛋白中只有其中一種蛋白含有。

表3 玉米素合成相關基因編碼蛋白的功能位點Table 3 Functional sites of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

2.6 二級結構和三級結構預測

二級結構預測結果見表4，在這5種蛋白中，包括的二級結構種類共有4種。除無規(guī)則卷曲區(qū)外，螺旋區(qū)最為常見，其中Zmco5和Zmczg1基因編碼蛋白都含有18個該種位點，Zmit4和Zmco4b基因編碼蛋白有17個，最少的Zmco12基因編碼蛋白也有16個。有一個特殊現(xiàn)象是，Zmco5基因編碼蛋白還含有1個位于第268位的精氨酸殘基為假定的域邊界位點。三級結構模擬的結果如圖6所示。這5種蛋白都有較為復雜的三級結構，圖中紅色末端為N末端，藍色末端為C末端。相對來說，分子量越大，其高級結構也越復雜。

2.7 基因表達及代謝通路分析

玉米素合成相關的5個基因在花粉中的表達統(tǒng)計結果如表5所示，表中數值為基因表達的三次重復的平均read count值。以常溫為對照，對于耐高溫脅迫的中地88來說，除Zmco5基因表達上調外，其余4個基因均顯示為表達下調。與此不同的是，對于不耐高溫脅迫的先玉335來說，Zmco5和Zmczg1均表達上調，其余3個基因表達下調。如以先玉335為對照，Zmco12和Zmczg1兩個基因在高溫環(huán)境下中地88表現(xiàn)為極顯著表達下調，但在常溫環(huán)境下，表達下調不顯著。該結果也說明，這5個玉米素合成相關基因其表達同時受到溫度和材料的影響。這幾個基因在KEGG通路中，具有不同的功能。其對應的代謝通路為Zmco5、Zmco4b和Zmco12均為k 00279；Zmit4為K 10760；Zmczg1為K 13495。這幾個代謝通路節(jié)點都在細胞內玉米素合成代謝途徑中起著重要的作用。

注：A為Zmco5；B為Zmit4；C為Zmco4b；D為Zmco12；E為Zmczg1。圖6 預測的玉米素合成相關基因編碼蛋白的三級結構Fig.6 Predicted tertiary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表4 玉米素合成相關基因編碼蛋白預測的二級結構Table 4 Predicted secondary structure of proteins encoded by the genes related to zeatin synthesis

表5 玉米素合成相關基因的表達統(tǒng)計Table 5 Expression analysis of genes related to zeatin synthesis

3 討論與結論

玉米素是控制玉米生長發(fā)育的重要激素，其表達與植株生長及抗逆密切相關[13-14]。玉米素在細胞內的生物合成非常復雜，從其代謝通路可知涉及到很多基因的表達產物[15-16]。就玉米而言，到底是哪些基因的表達參與玉米素的合成，這些基因的結構及其表達量與植株表型有何關系，相關研究鮮有報道。而轉錄組測序可以從整個基因組出發(fā)，研究某一器官或組織的所有基因的轉錄表達情況[17-19]，分析不同材料、不同生長部位在不同環(huán)境下的基因表達差異，以揭示其相關關系[20-21]。轉錄組測序技術在玉米這一作物中也有著廣泛應用[22-24]。

許多研究表明，玉米花粉是對高溫極其敏感的部位，高溫脅迫會導致花粉活力下降，甚至完全敗育，進一步影響玉米的產量和品質[25]。因此，培育花粉能耐高溫脅迫的玉米品種十分必要，而從分子水平認識花粉中基因表達、玉米材料及環(huán)境條件三者之間的相互關系，有助于理解花粉耐高溫脅迫的分子機理，而轉錄組測序分析是解決這一問題的有效手段。

因此，本研究借助二代測序技術，對中地88和先玉335兩個玉米品種的花粉基因在不同溫度條件下的表達情況進行了測序分析，發(fā)現(xiàn)有5個與玉米素合成相關的基因存在差異表達。這5個基因共分布于3條染色體，有3個為斷裂基因，2個為連續(xù)編碼基因。進一步分析了這5個基因的理化性質、磷酸化修飾、功能位點及結構。從基因的表達量來看，對于耐高溫脅迫的中地88材料，這5個基因表達差異達到2倍以上，若以常溫條件為對照，Zmco5基因表達上調，其余表達下調。但對花粉不耐高溫的先玉335來說，有不一樣的表現(xiàn)，Zmco5和Zmczg1為表達上調，其余3個為表達下調。這5個基因均處于玉米素生物合成通路中，對每一個基因的結構及功能的認識還需要進一步的試驗分析，此工作尚在進行之中。本研究結果為理解玉米耐高溫脅迫的分子機理提供了一些參考依據，為開展耐高溫玉米品種選育奠定理論基礎。