秦惠珍，鄒 蓉，柴勝豐，唐健民，韋 霄

(廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所/廣西喀斯特植物保育與恢復生態(tài)學重點實驗室，廣西 桂林 541006)

東興金花茶(Camelliaindochinensisvar. tunghinensis)為山茶科山茶屬常綠灌木[1]，是我國極小種群野生植物，分布范圍狹窄，現(xiàn)存面積僅52 hm2[2]。東興金花茶枝條濃密、花繁葉茂、樹型優(yōu)美，是培育茶花新品種的優(yōu)良種質(zhì)資源。此外，東興金花茶富含黃酮、多糖等有效成分[3-7]，具有清熱解毒、利尿消腫、止痢、收斂止血等功效[8-9]。由于東興金花茶生境脆弱，分布范圍小，種子自然更新困難，亂砍濫伐現(xiàn)象嚴重，已經(jīng)列入國家二級保護植物[10-11]。此外，因其分布范圍狹窄，被列為“極小種群野生植物”。

目前，關于金花茶組植物種質(zhì)收集和保存的研究較匱乏，對東興金花茶的種子繁殖鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，東興金花茶扦插成活率低且金花茶植物組培技術尚未得以攻破，推測有性生殖是其野外和引種栽培的主要繁殖途徑。在東興金花茶的原生境中，普遍存在花多果少的現(xiàn)象，結籽率非常低，且果實極易被動物采食，種子資源十分有限。東興金花茶作為茶族“皇后”中的一種，在園林園藝和科研中具有重要價值，但因其基本屬于野生狀態(tài)，缺乏足夠的苗木資源，使許多研究難以開展。種子萌發(fā)是植物天然種群更新的基礎[12]，種子萌發(fā)和幼苗的生長影響著植物種群的發(fā)展、生存和繁衍[13]。萌發(fā)階段是種群更新最薄弱的環(huán)節(jié)[14]，是種群生活虧損最嚴重的時期之一[15]，幼苗的自然更新不足以補充衰老個體的數(shù)量，種群就會逐漸走向滅亡。因此，了解東興金花茶自然種群種子萌發(fā)率和幼苗的生長特性可為揭示其瀕危機制、制定保護策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

東興金花茶種子于2020年12月采集于廣西防城金花茶自然保護區(qū)(108°06′41″E，21°44′48″N)。采集后及時去除果皮和雜質(zhì)，挑選飽滿、無病蟲害的種子用于觀察和測量，測量完成后于濕沙中保存。

1.2 種子形態(tài)特征觀測及種子吸水率測定

觀察并記錄東興金花茶種子的性狀及表型特征，隨機選取20粒種子，用游標卡尺測量種子的長和寬；隨機選取100粒種子測其重量，設5次重復，用百粒重估算千粒重，以平均值±標準差表示；隨機選取50粒種子，采用TTC染色法測定種子生活力，設3次重復；設計13個浸種時間段(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)測定種子吸水率，每處理20粒種子，重復3次，將種子浸泡在25 ℃恒溫水浴中。

種子吸水率(%)=[(種子吸水后重量-吸水前重量)/種子吸水前重量]×100%。

1.3 種子萌發(fā)特性觀測

選取無病蟲害的種子，于2021年1月初播種。在遮陰度為50%的遮陰棚播種，播種前種子用0.1%的KMnO4溶液消毒30 min，清水洗凈。播種容器為36 cm×28 cm的黑色營養(yǎng)袋，采用沙土∶黃土=3∶1(體積比)基質(zhì)進行播種，每處理設置3個重復，每個重復播種30粒。以芽頂出沙層為種子萌發(fā)標準，觀察到第1粒種子萌發(fā)后，每7 d統(tǒng)計一次萌發(fā)數(shù)，試驗時長120 d。進行常規(guī)澆水，保持基質(zhì)濕潤。

1.3.1種皮對種子萌發(fā)的影響

以完整種皮(ck)、種皮開口、去掉少部分種皮(少破)和完全去掉種皮(全破)的種子作為試驗材料。

1.3.2種子大小對萌發(fā)的影響

分別選取不同大小規(guī)格的種子進行試驗，大、中、小3個處理，每個處理3個重復，每個重復播種30粒種子，大種子的平均橫徑、縱徑、厚度和單粒重分別為3.14 cm、2.87 cm、2.78 cm和11.24 g；中等種子的平均橫徑、縱徑、厚度和單粒重分別為2.65 cm、2.43 cm、2.31 cm和9.26 g；小種子平均橫徑、縱徑、厚度和單粒重分別為2.54 cm、2.11 cm、1.89 cm和5.45 g。

1.3.3不同浸種時間對種子萌發(fā)的影響

分別將種子置于25 ℃恒溫水浴中，浸泡0、2、4、6、8、10 h后進行播種。

1.4 萌發(fā)指標計算

選用發(fā)芽勢(Germination Energy,GE)、萌發(fā)率(Germination Percentage,GP)、發(fā)芽指數(shù)(Germination Index,GI)、活力指數(shù)(Vigor Index，VI)等4個指標評價種子的活力，本試驗限定為30 d。

GE=(規(guī)定時間種子發(fā)芽數(shù)/播種種子數(shù))×100%；

GP(%)=(萌發(fā)種子數(shù)/播種種子數(shù))×100%；

GI=∑(Gt/Dt)，Dt為發(fā)芽時間，Gt為對應發(fā)芽時間的發(fā)芽粒數(shù)；

VI=地上部分鮮重×發(fā)芽指數(shù)。

1.5 幼苗生長參數(shù)測定

萌發(fā)試驗結束后，在不同大小、不同種群、不同冠層、不同種皮處理和不同浸種時間的5個處理中，分別隨機取10株早期萌發(fā)的幼苗，剪掉留存的種子，用清水洗凈擦干，用電子天平、游標卡尺、直尺測量并記錄株高、根長、基徑、地上部分鮮重、地上和地下部分生物量，其中生物量為在105 ℃烘箱中烘0.5 h后，再在65 ℃下烘至恒重。

1.6 幼苗光合特性測定

1.6.1光合-光響應曲線

種子萌發(fā)試驗結束后將幼苗單株移栽至20 cm×25 cm營養(yǎng)袋中，進行常規(guī)水肥管理。6月晴天09:00—11:30時測定光合-光響應曲線，測定時選取生長健壯的幼苗，相同葉位且完全展開的成熟葉片進行測量，每個株系進行3個生物學重復。測定項目包括氣孔導度(Stomatal conductance,GS)、凈光合速率(Net Photosythetic Rate,PN)、蒸騰速率(Transpiration Rate， TR)和胞間二氧化碳濃度(Intercellular carbon dioxide concentration, CI)。測定時光合有效輻射(Photosynthetically Active Radiation, PAR)設置為1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、80、60、40、20、0 μmol/(m2·s)，流量設置為500 μmol/s。光源由便攜式光合作用測定系統(tǒng)Li-6400(USA)自帶的紅藍光提供。

1.6.2光合-CO2響應曲線

測定時間和葉片選擇同光響應曲線，測定時設置葉室溫度為25 ℃，相對濕度為60%，根據(jù)光合作用光飽和點測定的結果，光源控制光強在600 μmol/(m2·s)以內(nèi)[當光強大于600 μmol/(m2·s)時，植株會出現(xiàn)光抑制現(xiàn)象]，光合測定儀的流速設定為500 μmol/(m2·s)，通過安裝高壓濃縮CO2小鋼瓶，設定CO2濃度梯度為0、50、100、150、200、300、400、500、600、800、1 000、1 200、1 600 μmol/mol。每個CO2濃度下控制測定時間為120 s，數(shù)據(jù)穩(wěn)定后儀器自動記錄葉片凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度。

根據(jù)得到的不同光合有效輻射和CO2濃度下的PN，在弱光狀態(tài)(0～100 μmol/mol擬合得到表觀量子效率Apparent quantum yield，AQY)，采用葉子飄[16]光合計算軟件分別擬合繪制光合速率的光合-光響應曲線、光合-CO2響應曲線，并得到最大凈光合速率(Maximum net photosynthetic rate,Pmax)、光飽和點(Light saturation point,LCP)、光補償點(Light compensation point,LSP)、CO2飽和點(CO2saturation point,CCP)、CO2補償點(CO2saturation point,LSP)、暗呼吸速率(Dark respiration,Rd)、光呼吸速率(Photorespiration rate,RP)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

種子萌發(fā)數(shù)據(jù)、幼苗生長數(shù)據(jù)和光合作用參數(shù)采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件(OneWay ANOVA, Duncan post hoc test,p<0.05)進行不同處理間的多重比較分析。統(tǒng)計值以平均值±標準誤表示。采用Origin 8.5軟件繪圖。

圖1 東興金花茶吸水特性曲線Fig.1 Water absorption property curve of C. indochinensis

2 結果與分析

2.1 種子形態(tài)特征和吸水特性

東興金花茶種子近球形，橫徑(2.63±0.34)cm，縱徑(2.45±0.28)cm，種皮黃棕色。種子單粒重(2.431±1.355)g，生活力(96.78±1.57)%，生活力較強。種子吸水特性見圖1，隨著浸種時間的延長，種子的吸水率提高，但隨著時間變化，種子吸水率的增長速度發(fā)生變化前6 h，種子吸水率增長速度最快，6 h后增長速度減慢，在22 h之后基本不再增長?？梢姡瑬|興金花茶種子浸種早期吸水快，中期變慢，后期便達到吸水飽和。

2.2 種皮破損對種子萌發(fā)及幼苗早期生長的影響

種皮完整度對東興金花茶種子萌發(fā)具有顯著性影響(表1)，種皮少破有助于加速種子萌發(fā)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于對照和全破處理(p<0.05)。種皮少破時種子的發(fā)芽率達47.22%，是ck的1.60倍，而全破處理種子萌發(fā)率僅13.33%，為ck的45%。

表1 不同處理條件下東興金花茶的萌發(fā)參數(shù)Table 1 Germination parameters of C. tunghinensis seeds in different treatments

如圖2所示，種皮少破處理幼苗的株高顯著高于對照和全破處理，且幼苗的地上部分和地下部分生物量顯著大于其他兩個處理。因此，對東興金花茶的種皮進行少破處理能顯著加快其萌發(fā)進程和生長速度，但將種皮完全去除時會嚴重影響其種子萌發(fā)。

圖2 種皮對東興金花茶生長的影響Fig.2 The effect of seed coat on C. indochinensis growth

2.3 種子大小對種子萌發(fā)及幼苗早期生長的影響

在種子萌發(fā)的過程中，大小不同的種子萌發(fā)參數(shù)具有顯著性差異，大種子的發(fā)芽勢、萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著高于中種子和小種子(表1)，其中大種子的發(fā)芽率接近100%，小種子的發(fā)芽率只有56.23%。

如圖3所示，對于幼苗的生長，無論是株高、地上部分的生物量還是地下部分的生物量，大種子均顯著大于中種子和小種子，而對于根長和地下部分的生物量而言，則具相反趨勢，小種子的根長顯著大于大種子和中種子，但地下部分的生物量與大種子并沒有顯著性差異，可見，小種子幼苗的生長更多養(yǎng)分集中在根等地下部分。

圖3 種子大小對東興金花茶生長的影響Fig.3 The effect of seed size on C. indochinensis growth

圖5 浸種時間對東興金花茶生長的影響Fig.5 The effect of soaking time on C. indochinensis growth

2.4 不同浸種時間對種子萌發(fā)及幼苗早期生長的影響

東興金花茶的發(fā)芽勢和發(fā)芽率因浸種時長不同而不盡相同，如圖4所示，東興金花茶的發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨浸種時間的增加呈相似的趨勢，均在浸種6 h時達最大值(發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別為50.00%和70.00%)，顯著高于其他浸種時長，超過6 h后東興金花茶的發(fā)芽勢和萌發(fā)率急劇降低(表1)。

圖4 不同浸種時間對東興金花茶發(fā)芽勢和萌發(fā)率的影響Fig.4 The effect of different soaking time on seed germination potential and germination rate of C. indochinensis

如圖5所示，浸種時間為6 h的幼苗株高(21.97 cm)顯著高于其他浸種時間(p<0.05)，其根長與浸種時間為0、2、4 h的幼苗無顯著性差異(p>0.05)，與浸種時間為8、10 h具有顯著性差異。浸種0、2、4、6 h幼苗的地上生物量顯著高于浸種8、10 h幼苗的地上生物量，且浸種時間為6 h的地下生物量顯著高于其他處理。可見東興金花茶最佳的浸種時間為6 h。

2.5 幼苗光合生理特性

2.5.1光響應曲線

光合-光響應曲線反映了植物不同光照條件進行光合作用的能力。參照秦惠珍等[17]對東興金花茶和長尾毛蕊茶成熟植株光響應曲線模型的研究，采用直角雙曲線修正模型對東興金花茶幼苗葉片的光響應曲線進行擬合，擬合程度較好(R2=0.99)，從圖6可以看出，在光照強度為0～250 μmol/(m2·s)時，凈光合速率隨光照強度的增強呈現(xiàn)直線上升的趨勢；在250～600 μmol/(m2·s)時，隨光照強度的增加凈光合速率增長速度減慢，然后趨于穩(wěn)定；光照強度大于600 μmol/(m2·s)時，凈光合速率有下降的趨勢，出現(xiàn)了光合抑制現(xiàn)象。根據(jù)葉子飄直角雙曲線模型進行擬合得到東興金花茶幼苗的Pmax、LSP、LCP、Rd、AQY等相關生理參數(shù)，東興金花茶的最大凈光合速率(Pmax)僅為2.67 μmol/(m2·s)，光飽和點(LSP)、光補償點(LCP)分別為484.25、2.68 μmol/(m2·s)，可見東興金花茶具有較低的光飽和點和光補償點，且其表觀量子效率為0.024，低于一般植物的實測表觀量子效率(AQY=0.03～0.05)，可見東興金花茶的幼苗具有明顯陰生植物的光合特性。此外，東興金花茶暗呼吸速率較低，為0.35 μmol/(m2·s)，說明其幼苗暗呼吸速率較小，有機物代謝效率高，這可能與植株處于幼苗階段，不斷積累有機物等特性有關。

2.5.2光合-CO2響應曲線

CO2響應曲線反映了植物利用CO2的能力。由圖7可知，東興金花茶幼苗的凈光合速率隨著CO2濃度的增大呈上升趨勢，在所測定的范圍內(nèi)(50～1 600 μmol/mol )并沒有呈下降或趨于穩(wěn)定的趨勢，表明東興金花茶幼苗能利用較高濃度CO2進行光合作用。根據(jù)葉子飄直角雙曲線模型對東興金花茶光合-CO2曲線進行擬合，得到東興金花茶幼苗的Amax、CSP、CCP及RP等相關生理參數(shù)，東興金花茶的最大凈光合速率(Amax)為12.24 μmol/(m2·s)，CO2飽和點(CSP)、CO2補償點(CCP)分別為2 317.00、3.83 μmol/(m2·s)，可見東興金花茶在CO2充足的情況下具有較高的凈光合速率，其幼苗具有較高的CO2飽和點和較低的CO2補償點，幼苗對CO2的利用范圍較廣。此外，東興金花茶的光呼吸速率RP為0.04，光呼吸速率較小，表明其消耗有機物的能力較弱。

圖6 東興金花茶幼苗光合-光響應曲線Fig.6 Photosynthesis-light response curve of C. indochinensis seedlings

圖7 東興金花茶光合-CO2響應曲線Fig.7 Photosynthesis-CO2 response curve of C. indochinensis

3 討 論

3.1 種皮對東興金花茶種子萌發(fā)的影響

種皮是種子的保護屏障，同時也是種子萌發(fā)的阻礙，有些種子的種皮經(jīng)過處理后能顯著提高種子的萌發(fā)率和成活率[18-19]。東興金花茶種皮蠟質(zhì)，可能與其在不良環(huán)境下防止水分快速丟失和病原菌入侵的保護機制有關[20]。本研究結果表明，種皮對東興金花茶種子萌發(fā)具有明顯的束縛作用，去掉少部分種皮后，種子萌發(fā)時間縮短，發(fā)芽勢和發(fā)芽率等各項指標顯著提高，株高、根長、地上生物量和地下生物量顯著增加，這與劉艷等[21]研究結論一致。東興金花茶種皮經(jīng)過開口處理后，發(fā)芽勢顯著提高，幼苗株高和根長等顯著高于對照，說明其種皮對種子的萌發(fā)具有較強的抑制作用，去除少部分種皮后有利于水分和其他物質(zhì)運輸，從而促進了種子的萌發(fā)。另外，東興金花茶完全去除種皮后，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、株高和根長等顯著降低，這可能是種皮破裂面積過大，使其種子極易受生物浸染腐爛，導致種子發(fā)芽率降低，這與趙東興等[21]研究馬檳榔種皮對種子萌發(fā)的影響結果相一致。此外，在采集東興金花茶種子時發(fā)現(xiàn)，東興金花茶果實成熟后果皮開始脫落，種皮易裂開，導致種胚多干燥失水或腐爛，這可能也是東興金花茶自然繁殖率低的關鍵原因之一。

3.2 種子大小對東興金花茶種子萌發(fā)的影響

種子大小決定種子內(nèi)部儲存營養(yǎng)物質(zhì)的含量，一般而言，大種子具有更強的競爭優(yōu)勢和存活能力[23-24]，而小種子在數(shù)量和傳播方式等方面更具有優(yōu)勢[25]。有研究表明，種子大小與種子萌發(fā)率顯著負相關[26]，與幼苗成活率正相關[27]。也有研究表明，種子大小與萌發(fā)率之間沒有直接的相關性[28]。本研究結果顯示，東興金花茶大種子的萌發(fā)率顯著高于小種子，與張玲衛(wèi)等[29]、朱雅娟等[30]研究得出的結果(草本植物中種子大小與萌發(fā)率呈現(xiàn)負相關)相反。一般來說，小種子在生態(tài)系統(tǒng)中更易形成土壤種子庫，具有更高的萌發(fā)率和成活率。本研究結果并不支持此觀點。東興金花茶大種子比小種子具有更高的萌發(fā)率，原因可能是其胚乳能提供更多后期種子萌發(fā)過程需要的營養(yǎng)物質(zhì)。

3.3 浸種時間對東興金花茶種子萌發(fā)的影響

種子吸水量與浸種時間有關，但并不代表浸種時間越長對種子萌發(fā)越有利[31]。宋松泉等[32]指出，種子萌發(fā)過程中浸種處理有利于種子原生質(zhì)膜的恢復和細胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換，從而加速種子的萌發(fā)進程，促進幼苗生長[33]。本研究中不同浸種時間對東興金花茶的發(fā)芽勢和發(fā)芽率具有顯著影響，浸種時間過長或過短都不利于種子萌發(fā)。研究表明，不同浸種時間對幼苗的生長影響不一致，但總的來說，浸種時間6 h，可以顯著提高東興金花茶種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，其幼苗的生長狀況也最好。

3.4 光照強度和CO2濃度對東興金花茶幼苗的影響

植物幼苗期是其生活史過程中最脆弱的階段[34]，特別是珍稀瀕危物種幼苗的生存和生長發(fā)育關系到該物種的有效管理和保護[35]。光合作用是植物生長發(fā)育的基礎，光照和CO2是影響植物光合作用的主要環(huán)境因子，對光照強度的適應幅度反映了其對生態(tài)環(huán)境的適應能力[36]，研究瀕危植物幼苗的光合特性是指導人工栽培的關鍵[37]。本研究結果表明，東興金花茶具有較低的光飽和點及光補償點，對光照的適應幅度較窄，且強光(光照照度大于600 μmol/(m2·s)出現(xiàn)了光抑制現(xiàn)象；而CO2飽和點較高，CO2補償點較低，對CO2的利用能力較強。整體上看，強光對東興金花茶幼苗的影響較大，在幼苗生長階段應提供遮陰環(huán)境，避免陽光直射；同時可施用碳肥等促進幼苗進行光合作用，增加有機物的積累。

3.5 東興金花茶種子和幼苗階段的生態(tài)適應及致瀕因素

種子形態(tài)特征和萌發(fā)方式是植物另一個關鍵的繁殖策略，關系幼苗的存活能力及個體未來的適合度[38]。尤其是瀕危植物，種子階段任何不利于種子萌發(fā)的因素都會對種群新個體的產(chǎn)生與補充產(chǎn)生直接影響[39]，可能會加劇物種的瀕危或滅亡。東興金花茶種子平均單粒重為2.431 g，遠高于喬木樹種種子的平均質(zhì)量0.328 g[40]，大粒種子營養(yǎng)貯備更多，有利于萌發(fā)的幼苗在山林較厚的凋落物中成功建植[41]。東興金花茶采取產(chǎn)生少量的大種子以便取得競爭優(yōu)勢的生殖策略，即K-對策[42]，種子產(chǎn)出的周期長、成本高[43]，種子成熟脫落后散落范圍小，傳播能力有限，種子難以擴張，東興金花茶進入生殖階段所需年限長，結實植株少，以至于林下幼苗數(shù)量少，加上前期的金花茶熱潮，東興金花茶大量成熟開花植株被砍伐，導致東興金花茶種群難以恢復，使其瀕危程度加劇。

東興金花茶野外果實成熟期為12月，處于干旱少雨的季節(jié)，少部分種子在樹上干枯死亡，部分種子成熟后脫落，隨動物踩踏、雨水、凋落物分解等因素埋入土壤中作為潛在種群，翌年春天溫度升高，雨水增多時萌發(fā)為種群補充后代。東興金花茶的萌發(fā)特性是其自然種群更新的障礙所在，較長的果實成熟期和種子休眠期不利于種群空間資源的迅速占據(jù)，東興金花茶從開花到果實成熟接近10個月，在這期間果實和種子要忍耐細菌、病蟲害和動物撿食等各種環(huán)境壓力。由實驗可知，東興金花茶的種子萌發(fā)需要一定的水分條件，水分過少或過多均不利于種子萌發(fā)。東興金花茶果實成熟期在干旱少雨的季節(jié)，掉落時土壤水分少，種子難以萌發(fā)；翌年春季若雨量過多則導致土壤含水量高，種子易發(fā)霉變質(zhì)，降低種子的萌發(fā)率；此外，東興金花茶幼苗對強光特別敏感，強光下其光合作用受到抑制，光照適應范圍狹窄，這也是導致東興金花茶自然種群幼苗少、天然更新困難的重要因素。即種子萌發(fā)時對土壤水分的要求和幼苗對光照的要求難以適應多變的環(huán)境條件可能是其稀有的重要原因。因此，需加強東興金花茶原生境的生態(tài)保護，注意保護其上層植被，為東興金花茶提供一定的蔭蔽度。此外，東興金花茶幼苗的生長緩慢，植株矮小，與競爭能力強的植物競爭難以取得優(yōu)勢，也是其瀕危的另一重要原因。種子萌發(fā)和幼苗階段的生長受阻只是東興金花茶致瀕的一方面原因，應結合東興金花茶的傳粉生物學和分子遺傳學等進行研究，從東興金花茶的繁殖和遺傳多樣性水平了解其瀕危機制。

4 結 論

東興金花茶種子存在休眠期，萌發(fā)時間較長，蠟質(zhì)種皮延長了種子萌發(fā)的時間，去掉少部分種皮可以促進其種子的萌發(fā)和幼苗的生長。東興金花茶大粒種子貯存營養(yǎng)多，種子萌發(fā)和幼苗生長快。東興金花茶種子萌發(fā)需要一定的水分條件，浸種可以加速種子的萌發(fā)。總體上看，東興金花茶種子萌發(fā)過程長，幼苗生長慢，對光照要求嚴格，不利于種群空間資源的迅速占據(jù)，這可能是東興金花茶種群衰落，形成極小種群瀕危植物的重要原因。人工培育的東興金花茶應及時采摘成熟果實，避免果實干枯失去活性，采摘后及時去掉外果皮留種皮，采用河沙等透氣性較好的基質(zhì)進行播種或沙藏。