易沭遠(yuǎn)，王湛昌，劉 忠，陽永學(xué)，李秀麗，陳艷清，陳法志

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，湖北 武漢 430073)

柳葉白前為蘿藦科鵝絨藤屬植物，又名鵝管白前，為中國藥典收錄的兩種白前之一[1]。全株藥用，有清熱解毒，降氣下痰之功效[2]。目前，關(guān)于柳葉白前的功能成分有不少研究，根莖包含的化學(xué)成分如甾體、脂肪酸、甾醇、多糖及其他揮發(fā)性物質(zhì)等均已有廣泛研究，各類成分在鎮(zhèn)咳、抗炎等方面的藥理學(xué)功能也逐漸有了明確的解析[3]。柳葉白前的根莖常被用來治肺病、小兒疳積、感冒咳嗽及慢性支氣管炎等，冬季需求量較大，近年來價格持續(xù)走高[4]。

柳葉白前在南方多省均有分布，多為野生，雖然產(chǎn)區(qū)較大，但各地柳葉白前資源的品種、性狀和生長勢都有明顯差別，導(dǎo)致藥材的品質(zhì)不一[5]。有研究證實，不同來源的柳葉白前，其發(fā)揮藥理功能的資源浸出物和多糖含量均不一致，無法匹配工業(yè)需求[6-7]。而且，野生柳葉白前的生長范圍較小，資源分散，產(chǎn)量不足，采挖難度較大。目前，只有人工馴化栽培的家種白前總體品質(zhì)均一、產(chǎn)量和性狀穩(wěn)定，可滿足市場需要。

在中藥材的人工栽培過程中，種子是決定采收后藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素[8]，種子的特性與田間出苗率密切相關(guān)，但柳葉白前的種子生理特征研究目前尚未見報道。因此，本研究開展了柳葉白前種子的相關(guān)實驗，擬闡明柳葉白前種子的生物學(xué)特性和表征，研究種子的發(fā)芽適宜條件，為提高柳葉白前種子的萌發(fā)率和出苗率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗使用的柳葉白前角果購于武漢市白前堂藥材種植專業(yè)合作社；白菜種子為武漢九頭鳥種苗有限公司的四季中其小白菜，水稻種子為常規(guī)秈稻品種黃華占。試劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)和CaCl2為國產(chǎn)分析純；GA3購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1角果特征與種子數(shù)量的測定

隨機(jī)選取30個柳葉白前角果，除去果殼和種纓，觀察角果內(nèi)的種子飽滿度，統(tǒng)計飽滿粒和干癟粒的數(shù)量；依次用游標(biāo)卡尺測量角果長度、結(jié)節(jié)寬度、中段寬度、尾段寬度，取平均值，得到角果的平均長度和寬度；將30個角果剝出種子，統(tǒng)計每個果實的種子粒數(shù)。

1.2.2千粒重的測定

將純凈、飽滿種子分為4份，從每份中隨機(jī)選取250粒，1 000粒為1組，用萬分之一電子天平稱重。

1.2.3透水性和浮水率的測定

選取200粒種子，稱取重量，在無菌水中浸泡，在25 ℃恒溫條件下吸脹，每隔1 h取出種子稱重，至種子恒重為止；稱重時用濾紙吸干表面水分后，在萬分之一電子天平上稱重，重復(fù)3次。

吸水率(%)=[(浸種后重量-浸種前重量)/浸種前重量]×100%。

選取100粒種子，投入水中，充分?jǐn)嚢枵鹗幒箪o置5 min，統(tǒng)計下沉的種子數(shù)量，計算浮水率，重復(fù)3次。

1.2.4含水率的測定

在電子天平上稱取5 g白前種子粉末3份，稱取5 g白前種子3份，共6份種子樣品分別放入烘干后稱重的稱量瓶中，在110 ℃開蓋烘干6 h后，取出蓋上蓋子稱重，并計算含水率。

含水率(%)=[(烘干前重量-烘干后重量)/烘干前重量]×100%。

1.2.5柳葉白前種子生活力的測定

采用TTC法[9]，用30～35 ℃溫水浸種12 h，使種子充分吸脹。然后將種子沿胚的中線縱切成兩半，100粒為1個重復(fù)，3次重復(fù)，置于0.5%TTC 溶液中，在30～35 ℃條件下避光染色1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，去離子水反復(fù)沖洗至不再洗出顏色為止，觀察種子胚部的染色情況，胚染成紅色的為有生活力的種子，計算種子的生活力。

1.2.6柳葉白前種子的微形態(tài)觀察

將柳葉白前種子用濃度為3%的戊二醛固定過夜，清洗后用系列梯度酒精脫水后干燥，在掃描電鏡(HITACHI SU-8010)下觀察，觀察面長5～6 mm，厚度約2 mm。該部分操作由武漢普奈斯生物科技有限公司完成。

1.2.7柳葉白前種子萌發(fā)實驗

將柳葉白前種子用 0.3%高錳酸鉀水溶液消毒15 min，用無菌水沖洗干凈，并用濾紙將種子表面水分吸干。將消毒后的種子均勻排布在培養(yǎng)皿內(nèi)，設(shè)定光照周期為光照12 h/黑暗12 h，分別在25 ℃/15 ℃、30 ℃/20 ℃、35 ℃/25 ℃等5組變溫處理下觀察發(fā)芽情況，每組為50粒種子，重復(fù)3組。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為待突破種皮的胚軸長度達(dá)到2 mm以上。每天統(tǒng)計發(fā)芽率直到穩(wěn)定。

1.2.8柳葉白前種子的引發(fā)實驗

以GA3和CaCl2為引發(fā)劑，各設(shè)置3個濃度梯度，其中GA3濃度分別為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L，CaCl2濃度分別為100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L。將種子浸泡在20 mL引發(fā)劑中，在20 ℃黑暗條件下引發(fā)處理24 h，引發(fā)結(jié)束后，用去離子水沖洗2 min，用吸水紙吸干表面水分，在自然條件下回干24 h，均勻放置到培養(yǎng)皿中，每個濃度下設(shè)置3個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放置15粒種子，然后在光照培養(yǎng)箱中開展25 ℃/15 ℃晝夜變溫發(fā)芽試驗。以ddH2O引發(fā)為對照，統(tǒng)計每天發(fā)芽率。重復(fù)3組。

1.2.9柳葉白前種子浸提物抑制白菜和水稻種子萌發(fā)實驗

將柳葉白前種子去掉絹毛后稱取5 g研磨成粉末，置于錐形瓶內(nèi)，加入80%甲醇溶液50 mL，在4 ℃下浸提36 h，濾除殘渣，重復(fù)提取3次，合并濾液。甲醇浸提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸干后，加入蒸餾水，分別調(diào)節(jié)剩余物質(zhì)質(zhì)量濃度至0.01 g/mL、0.05 g/mL、0.1 g/mL；將白菜種子和水稻種子用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡消毒30 min，蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干種子表面水分；取不同濃度浸提液10 mL，將白菜種子和水稻種子浸泡24 h后，將種子均勻放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)50粒種子，以蒸餾水處理為對照，放在25 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，統(tǒng)計5 d發(fā)芽率，并測量根高和苗長。

注：1～3為種子表皮形態(tài)；4～6為種子橫切面形態(tài)。圖1 柳葉白前種子的微形態(tài)Fig.1 Microstructural features of Cynanchum stauntonii seed

表1 不同溫度下柳葉白前種子萌發(fā)率Table 1 Seed germination rate of Cynanchum stauntonii

2 結(jié)果與討論

2.1 柳葉白前角果與種子特征

柳葉白前的果實中，每個角果內(nèi)飽滿粒約為1.2粒，干癟粒約為16.5粒；角果平均長度約為11.6 cm，結(jié)節(jié)寬度約為0.4 cm，中段寬約1.1 cm，尾段寬約0.4 cm。每個角果內(nèi)種子約為17粒。種子平均長度為1.7 cm，寬度為0.3 cm，厚度為0.09 cm。種子的千粒重為6.25 g，透水率為46%，浮水率為23.33%，含水率為22.9%。TTC染色1～5 h，柳葉白前種子的生活力分別為43%、63%、74%、75%和77%。

柳葉白前角果呈狹長卵形，頭部帶有白色絹毛，種子呈披針形，表面為褐色[10]。如圖1所示，柳葉白前種子表皮呈現(xiàn)鵝絨藤屬植物種子的典型特征：細(xì)胞的邊緣略微隆起，表面凹陷呈網(wǎng)狀，且網(wǎng)孔不規(guī)則。種子的橫切面有明顯的溝槽。

2.2 柳葉白前種子萌發(fā)率

由表1可看出，在25 ℃/15 ℃下，柳葉白前種子從培養(yǎng)第4天開始發(fā)芽，有絹毛的種子4 d萌發(fā)率為1.9%，7 d時增加到6.8%；無絹毛的種子4 d萌發(fā)率為8.5%，7 d時增加到13.3%。在30 ℃/20 ℃下，柳葉白前種子從培養(yǎng)第3天開始發(fā)芽，有絹毛的種子3 d萌發(fā)率為3.8%，7 d時增加到34.3%；無絹毛的種子3 d萌發(fā)率為2.9%，7 d時增加到30.5%。在35 ℃/25 ℃下，柳葉白前種子從培養(yǎng)第3天開始發(fā)芽，有絹毛的種子3 d萌發(fā)率為12.3%，7 d時增加到54.3%，5～7 d的種子萌發(fā)率與3 d萌發(fā)率差異極顯著。無絹毛的種子3 d萌發(fā)率為15.4%，7 d時增加至60%，且6 d和7 d時種子萌發(fā)率與3 d時差異極顯著(圖2 A)。

注：A為有絹毛種子的萌發(fā)率；B為無絹毛種子的萌發(fā)率；“**”代表p<0.01水平的顯著性差異。下同。圖2 不同溫度梯度下柳葉白前種子的萌發(fā)率Fig.2 Germination rate of Cynanchum stauntonii seeds under various temperature gradient

有絹毛的種子，在35 ℃/25 ℃下，5 d、6 d和7 d的萌發(fā)率與25 ℃/15 ℃溫度下同一時期的種子萌發(fā)率表現(xiàn)出極顯著差異(圖2 A)；無絹毛的種子在6 d和7 d，35 ℃/25 ℃下種子萌發(fā)率與另外2個溫度梯度下種子6 d和7 d的萌發(fā)率表現(xiàn)出顯著差異(圖2 B)。實驗結(jié)果表明，在不同的溫度梯度下，無絹毛和有絹毛柳葉白前種子的萌發(fā)率均隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，且以35 ℃/25 ℃下種子萌發(fā)率最高，30 ℃/20 ℃次之，25 ℃/15 ℃下最低。

表2 不同濃度GA3處理對柳葉白前種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of gibberellin with various concentrations on Cynanchum stauntonii seed germination

2.3 引發(fā)劑對柳葉白前種子萌發(fā)的影響

由表2可知，與未用GA3處理的種子相比，培養(yǎng)2 d時，在50 mg/L、100 mg/L濃度下培養(yǎng)的種子萌發(fā)率較為一致，在200 mg/L濃度下萌發(fā)率增加了38.7%；培養(yǎng)3 d后，在50 mg/L，100 mg/L和200 mg/L的GA3處理下，萌發(fā)率分別增加了15.1%，21.6%和43.6%；在50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的GA3處理下，培養(yǎng)4 d后，萌發(fā)率分別增加了12.5%、25.4%和46.7%；培養(yǎng)5 d后，萌發(fā)率分別增加了5.9%、22.1%和38.0%；培養(yǎng)6 d后，萌發(fā)率分別增加了3.0%、21.2%和44.2%；培養(yǎng)7 d后，萌發(fā)率分別增加了1.8%、20.8%和41.4%。

如圖3所示，在不同GA3濃度下，培養(yǎng)2 d種子的萌發(fā)率并無明顯差異，但在200 mg/L的GA3處理下，培養(yǎng)6 d的種子與培養(yǎng)2 d的種子萌發(fā)率出現(xiàn)顯著差異。以上結(jié)果說明，GA3可促進(jìn)柳葉白前種子的萌發(fā)，以200 mg/L的GA3處理效果最佳。

注：“*”代表p<0.05水平的顯著性差異。下同。圖3 不同濃度GA3處理下柳葉白前種子的萌發(fā)率Fig.3 Effects of gibberellin with various concentrations on Cynanchum stauntonii seed germination

由表3可見，與對照相比，在CaCl2濃度為100 mg/L時，各培養(yǎng)2 d、3 d、4 d、5 d后，種子的萌發(fā)率分別下降了55.6%、10.1%、9.9%和4.4%，培養(yǎng)6 d后，萌發(fā)率與未處理的種子相同，培養(yǎng)7 d后，種子萌發(fā)率增加了3.0%；在CaCl2濃度為200 mg/L時，培養(yǎng)2 d后，種子的萌發(fā)率下降了17.0%，培養(yǎng)3 d時，種子的萌發(fā)率升高了6.6%，培養(yǎng)4 d、5 d、6 d、7 d時，種子萌發(fā)率分別下降了6.1%、3.0%、3.0%和4.5%；在CaCl2濃度為400 mg/L時，培養(yǎng)2 d時，種子的萌發(fā)率下降了44.4%，培養(yǎng)3 d時，種子的萌發(fā)率下降了10.1%，培養(yǎng)4 d、5 d、6 d、7 d時種子萌發(fā)率分別下降了10.1%、7.5%、3.0%和4.5%。

表3 不同濃度CaCl2對柳葉白前種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of calcium chloride with various concentrations on Cynanchum stauntonii seed germination

如圖4所示，用3種不同濃度CaCl2處理的種子，培養(yǎng)2～3 d時萌發(fā)率均與培養(yǎng)5 d時的種子萌發(fā)率有極顯著差異，而未用CaCl2處理的種子2～3 d的萌發(fā)率與培養(yǎng)5 d時的種子萌發(fā)率無顯著差異。以上結(jié)果說明，培養(yǎng)2～3 d時，大部分種子萌發(fā)率出現(xiàn)略微下降，且不同濃度的CaCl2溶液對種子萌發(fā)的作用水平一致，CaCl2處理對柳葉白前種子萌發(fā)率無明顯促進(jìn)作用。

2.4 柳葉白前種子浸提液對白菜種子和水稻種子的影響

由表4可知，當(dāng)浸提液濃度為0時，白菜種子發(fā)芽率僅為40.7%。隨著浸提液濃度增大，白菜種子發(fā)芽率增加趨勢明顯。 浸提液濃度為0.01 g/mL時，白菜種子萌發(fā)率為74.2%；浸提液濃度為0.05 g/mL時，白菜種子萌發(fā)率為76.3%；當(dāng)浸提液濃度為0.1 g/mL時，白菜種子萌發(fā)率增加到了88.3%，與浸提液濃度為0時相比，分別增加了33.5%，35.6%和47.6%。

在3種浸提液濃度下，白菜種子發(fā)芽率與浸提液濃度為0時的發(fā)芽率均呈顯著差異(圖5 A)；根高分別增加了6.6%，32.4%和22.3%(表4，圖5 B)，苗長分別增加了17.2%，12.6%和25.2%(表4，圖5 C)。說明柳葉白前種子浸提液能夠促進(jìn)白菜種子萌發(fā)。

表4 不同濃度柳葉白前種子浸提液對白菜種子發(fā)芽的影響Table 4 Effects of Cynanchum stauntonii seed extract with various concentrations on cabbage seed germination

圖4 不同濃度CaCl2處理下柳葉白前種子的萌發(fā)率Fig.4 Effects of calcium chloride with various concentrationson seed germination of Cynanchum stauntonii

如表5所示，當(dāng)浸提液濃度為0時，水稻種子5 d發(fā)芽率為84%；浸提液濃度為0.01 g/mL、0.05 g/mL和0.1 g/mL時，水稻種子的發(fā)芽率分別下降了10.7%、7.7%和11.9%。浸提液濃度為0時，水稻種子的根高和苗長分別為2.77 cm和2.27 cm；浸提液濃度為0.01 g/mL、0.05 g/mL和0.10 g/mL時，水稻種子根高分別下降了12.3%，56.3%，5.1%，芽長分別下降了48.5%，69.2%和58.6%。

表5 不同濃度柳葉白前種子浸提液對水稻種子發(fā)芽的影響Table 5 Effects of Cynanchum stauntonii seed extract with various concentrations on rice seed germination

不同濃度浸提液對水稻種子的發(fā)芽率無明顯影響(圖6 A)，但水稻種子發(fā)芽后，在0.05 g/mL浸提液濃度下的根高與其他3個濃度下的根高差異極顯著(圖6 B)；3種浸提液濃度下，苗長與未用浸提液處理時水稻種子的差異極顯著(圖6 C)。說明柳葉白前種子浸提液對水稻種子生長有抑制作用，以浸提液濃度為0.05 g/mL時最為明顯。

3 討 論

3.1 柳葉白前種子外觀特性

根據(jù)《中國植物志》(第63卷)中對鵝絨藤屬的分類，柳葉白前屬于鵝絨藤屬中的催吐白前組。本研究結(jié)果表明，柳葉白前的種子外觀與表面紋飾與其他幾類屬于催吐白前組的植物如合掌消、潮風(fēng)草、大理白前和毛白前等差異不大[11]，但種子大小有較大差異。

3.2 柳葉白前種子萌發(fā)最適溫度條件

柳葉白前種子萌發(fā)受溫度的影響較為顯著，溫度較低時，種子不萌發(fā)；最適萌發(fā)溫度為25～35 ℃。在實際生產(chǎn)中，柳葉白前的播種時間一般在2月上旬，環(huán)境溫度較低[12]。播種過程可采用溫水浸泡種子，播種后噴灑溫水，利用塑料薄膜等增溫方式促進(jìn)種子快速萌發(fā)。

圖5 不同濃度柳葉白前種子浸提液對白菜種子發(fā)芽的影響Fig.5 Effects of Cynanchum stauntonii seed extract with various concentrations on cabbage seed germination

圖6 不同濃度柳葉白前種子浸提液對水稻種子發(fā)芽的影響Fig.6 Effects of Cynanchum stauntonii seed extract with various concentrations on rice seed germination

3.3 柳葉白前種子適用引發(fā)劑

對不同類型的中藥材種子進(jìn)行針對性的有效處理后能提高種子的活力，達(dá)到增加出苗率的效果[13]。GA3和CaCl2都是廣泛應(yīng)用的能促進(jìn)種子萌發(fā)的化學(xué)試劑，本研究證明，GA3可促進(jìn)柳葉白前種子的萌發(fā)，在200 mg/L GA3濃度下，種子的發(fā)芽率達(dá)71.4%，接近本研究中最高值77%，說明高濃度的GA3作用能夠激發(fā)柳葉白前種子潛在的萌發(fā)能力；而CaCl2處理對種子萌發(fā)無促進(jìn)作用，種子萌發(fā)率反而下降。因此，柳葉白前在播種時可輔以GA3處理提高發(fā)芽率。

3.4 柳葉白前種子浸提液對白菜和水稻種子發(fā)芽的影響

柳葉白前種子的浸提物對白菜種子發(fā)芽有促進(jìn)作用；對水稻種子萌發(fā)率影響不大，但影響根高和苗長?？梢酝茰y柳葉白前種子內(nèi)同時含有促進(jìn)白菜種子發(fā)芽和抑制水稻種子萌發(fā)生長的化學(xué)成分。