李偉忠，馬洪娜，吳依琳，梁春波，周 英，檀龍顏

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025)

喀斯特地區(qū)土壤中，高濃度的Ca2+能夠顯著抑制植物的生長、種類和群落的分布[1]。種子萌發(fā)過程是植物生活史中最重要的階段，與幼苗的成活率密切相關(guān)。關(guān)于Ca2+脅迫對種子萌發(fā)影響的研究方面，呂朝燕和田維怡[2]觀察了Ca2+脅迫對白車軸草(Trifoliumrepens)、紫云英(Astragalussinicus)、紫花苜蓿(Medicagosativa)種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)鈣脅迫下紫花苜蓿種子的萌發(fā)率恢復(fù)較好，對高濃度Ca2+環(huán)境的適應(yīng)能力要好于白車軸草和紫云英，是喀斯特地區(qū)較為適宜的栽培牧草品種。同時，檀龍顏等[3]觀察了Ca2+脅迫對金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)種子萌發(fā)的影響，顯示在低濃度Ca2+脅迫時，萌發(fā)種子主要受到滲透脅迫，細胞通過抗氧化酶清除活性氧自由基，而在高濃度Ca2+脅迫時，萌發(fā)種子可能受到離子毒害作用。此外，黃麗容等[6]研究了Ca2+脅迫下越南槐(Sophoratonkinensis)種子萌發(fā)過程中的生理特性，顯示鈣脅迫下主要產(chǎn)生滲透脅迫。這些結(jié)果對植物種子萌發(fā)過程響應(yīng)鈣脅迫的機制有一定的認識，但尚不明確。

在后基因組時代，植物對環(huán)境刺激的響應(yīng)可能有所不同，因此利用系統(tǒng)生物學(xué)方法提高作物耐受性已成為人們關(guān)注的焦點。植物代謝組學(xué)無疑已成為深入了解非生物脅迫下適應(yīng)性代謝反應(yīng)調(diào)控不可或缺的系統(tǒng)生物學(xué)工具[4-5]。通過代謝產(chǎn)物的變化來了解Ca2+脅迫響應(yīng)的全面調(diào)控系統(tǒng)，為確定在Ca2+耐受過程中發(fā)揮重要作用的特定代謝產(chǎn)物提供了可能，這可以作為未來育種和生物技術(shù)應(yīng)用的生物標志物。特別是考慮到在喀斯特環(huán)境下評估大量基因型表現(xiàn)所產(chǎn)生的瓶頸，這種基于生物標記物的篩選作為一種使作物具備Ca2+耐受性的替代方法，越來越具有可信度。本試驗旨在研究不同濃度Ca2+脅迫下越南槐種子萌發(fā)階段的代謝調(diào)節(jié)，探索在種子萌發(fā)階段存在的遺傳變化，以確定具有影響的代謝物，并開發(fā)作為候選的Ca2+耐受性生物標記物，為進一步了解越南槐種子萌發(fā)對Ca2+脅迫的響應(yīng)機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

越南槐種子于2021年9月采自貴州省紫云縣種植基地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)檀龍顏副教授鑒定為豆科槐屬(Sophora)越南槐(Sophoratonkinensis)的種子。室內(nèi)干燥后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 種子消毒和脅迫處理

以2%次氯酸鈉溶液浸泡20 min對越南槐種子進行消毒；以蒸餾水為對照(ck)，50、100 mmol/L CaCl2溶液作為鈣脅迫處理條件；將50粒大小均勻、飽滿的種子置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿中，基質(zhì)為2層定性濾紙，分別用蒸餾水、50、100 mmol/L CaCl2溶液潤濕基質(zhì)，每天09：00時補充溶液；培養(yǎng)皿置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)，黑暗，25 ℃。發(fā)芽標準為胚根突破種皮1 mm以上，不超過3 mm，發(fā)芽結(jié)束以連續(xù)5 d無新發(fā)芽種子為標準，本實驗觀察20 d，實驗過程中及時補充處理液[6]。收集萌發(fā)種子于5 mL凍存管，每個樣品3粒種子，液氮速凍，置-80 ℃保存，用于提取代謝物。

1.3 試 劑

校正液(AB Sciex集團公司，美國)；乙腈，色譜級(Merck技術(shù)有限公司，德國)；甲醇，色譜級(Merck技術(shù)有限公司，德國)；甲酸，色譜級(科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料公司，中國)。

1.4 儀 器

島津超高效液相色譜儀30 A(島津，日本)；AB Sciex Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(AB Sciex集團公司，美國)；Peak View 軟件(AB Sciex集團公司，美國)；Master View 軟件(AB Sciex集團公司，美國)；KDC-160 HR型高速低溫離心機(科大創(chuàng)新股份公司，中國)；VX-Ⅱ多管渦旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司，中國)；PB 1501-N型電子分析天平(梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司，中國)；KQ-250 DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)；SL-1000 XLS移液器(梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司，中國)。

1.5 樣本制備

取各個樣本進行稱量，加入10倍量的甲醇，充分研磨后，超聲30 min，離心15 min(10 000 r/min，4 ℃)，取上清液，過0.22 μm濾膜過濾，即得樣本品溶液。同時分別取各個供試品樣本各50 μL，混合成用一個樣本作為QC樣本。

1.6 液相條件

色譜柱:ACQUITY UPLCTM HSS C 18(5 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm)(Waters集團公司，美國)；流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為0.1%甲酸-乙腈；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；梯度洗脫為0～3.5 min，5%～20% B；3.5～6 min，20%～40% B；6～6.5 min，40% B；6.5～12 min，40%～70% B；12～12.5 min，70% B；12.5～18 min，70%～100% B；18～25 min，100% B。色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進行全掃描。

1.7 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜分析采用電噴霧電離源在正負離子模式下進行。MS (m/z)的掃描范圍為100～1 200 amu。MSMS的掃描范圍(m/z)為50～1 200 amu。源參數(shù)設(shè)置如下：掃描類型TOF；源溫度600 ℃；解簇電壓100 V；氣源1為55 psi；氣源2為65 psi；氣簾氣為35 psi；離子噴射電壓為5 500 V/4 000 V；碰撞能量，MS模式下15 eV，MSMS模式下35 eV/～35 eV；碰撞電壓差為20 eV。

1.8 潛在生物標記物篩選及鑒定

采用主成分分析和基于正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型對投影值(VIP)中的變量重要度進行分析。用SPSS數(shù)據(jù)軟件進行多重比較分析。同時采用VIP值>1，p<0.05，篩選差異表達的代謝物。使用Peak View軟件和Progenesis QI軟件鑒定代謝物。每個實驗重復(fù)6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異代謝物鑒定

前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著CaCl2溶液濃度的增加，萌發(fā)種子的萌發(fā)率和含水量逐漸降低，但總可溶性糖和丙二醛含量增加，過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加[6]?；谏鲜鼋Y(jié)果，對0、50、100 mmol/L CaCl2溶液處理條件下萌發(fā)的種子進行了比較代謝組學(xué)分析。

本試驗通過主成分分析(PCA)以確定不同處理樣品和質(zhì)量檢測(QC)樣品之間的代謝物的變化，結(jié)果表明，四組樣本間分離明顯(圖1)。為識別潛在的變量，通過比較變量重要度投影(VIP)評分(>1.0)來篩選差異代謝物，p<0.05，然后利用在線數(shù)據(jù)庫對這些差異代謝物進行鑒定。

注：(a)為正極模式；(b)為負極模式；用不同顏色的圓圈或三角形表示樣品，黑色代表0 mmol/L CaCl2處理樣品，紅色代表50 mmol/L CaCl2處理樣品，綠色代表100 mmol/L CaCl2處理樣品，藍色代表QC樣品。圖1 不同處理樣本和QC樣本的PCA評分圖Fig.1 PCA scores map of different treatment samples and QC samples

2.2 CaCl2溶液濃度為0、50 mmol/L處理組之間的差異代謝物

共鑒定出36種差異表達代謝物。與0 mmol/L組相比，50 mmol/L組21種代謝物表達上調(diào)，15種表達下調(diào)(見表1)。上調(diào)的代謝物中，有5種異黃酮類化合物(glycitin；prunetin；calycosin；3′,4′-Dimethoxy-7-hydroxyisoflavone；6,7,4′-trihydroxyisoflavone)、11種黃酮類化合物(naringenin-7-O-glucoside；vitexin-2″-O-rhamnoside；Apigenin 7-O-(2 G-rhamnosyl)gentiobioside;apigenin 7-glucoside；pinocembrin；naringenin；luteolin；isoliquiritin；pectolinarigenin；8-prenylnaringenin；oroxin A)、1個β-sitosterol，1個2-linoleoylglycerol，1個L-isoleucine,1個reduced L-glutathione，1個frangulin B。下調(diào)的代謝物中，2個生物堿(adenosine；oxymatrine)，4個磷酸膽堿化合物(1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine；1-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine;1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine;1-hexad-ecanoyl-2-octadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphocholine),1個1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,4個磷酸乙醇胺化合物(1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N，N-dimethyl;1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine；1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine；1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)，4種有機酸化合物(3-furancarboxylic acid；DL-malic acid；citric acid；deoxycholic acid)。

2.3 CaCl2溶液濃度為0、100 mmol/L處理組之間的差異代謝物

共鑒定出14種差異表達代謝物。與0 mmol/L組相比，100 mmol/L組有9種代謝物表達上調(diào)，5種代謝物表達下調(diào)(見表2)。上調(diào)的代謝物中，有2種異黃酮化合物(calycosin；6,7,4′-trihydroxyisoflavone)，5類黃酮化合物(luteolin；pectolinarigenin；fustin；oroxin A；vitexin-2″-O-rhamnoside)1個 phytosphingosine，1個1-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine。下調(diào)的代謝物中,3個有機酸化合物(3-furancarboxylic acid；DL-malic acid；citric acid)1個1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，1個2-Palmitoyl-rac-glycerol。

2.4 CaCl2溶液濃度為50、100 mmol/L處理組之間的差異代謝物

鑒定出24種差異表達代謝物。與50 mmol/L組相比，100 mmol/L組有10種代謝物表達上調(diào)，14種代謝物表達下調(diào)(見表3)。上調(diào)的代謝物中，1個fustin，2個異黃酮類化合物(6,7,4′-Trihydroxyisoflavone；Genistein)，2個磷酸膽堿化合物(1-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine;1-Hexadecanoyl-2-octadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，1個1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine,1個1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，2個有機酸(deoxycholic acid；3 β-Hydroxy-5-cholenoic acid)，1個phytosphingosine。下調(diào)的代謝物中，2個異黃酮類化合物(glycitin;3′,4′-Dimethoxy-7-hydroxyisoflavone)，9個黃酮類化合物(pinocembrin;naringenin;isoliquiritin;8-prenylnaringenin;oroxin A;naringenin-7-O-glucoside;vitexin-2″-O-rhamnoside;7-Hydroxyflavanone;homobutein)，1個frangulin B，1個2-Palmitoyl-rac-glycerol，1個ricinoleic acid methyl ester。

表1 50 mmol/L組萌發(fā)種子和0 mmol/L組萌發(fā)種子差異代謝物Table 1 Differential metabolites of germinated seeds in 50 mmol/L group and 0 mmol/L group

2.5 代謝調(diào)解途徑

為了全面了解種子在鈣脅迫下代謝組的變化情況，構(gòu)建了種子代謝網(wǎng)絡(luò)，突出鈣脅迫反應(yīng)中所涉及的特定途徑和網(wǎng)絡(luò)的變化。這些途徑主要是從KEGG數(shù)據(jù)庫和文獻中檢索到的信息構(gòu)建的(圖2 a～圖2 c，圖3 a～圖3 c)。鈣脅迫顯著改變了種子代謝組，其中類黃酮和異黃酮類化合物合成、脂類化合物合成和有機酸合成的變化幅度最大。

表2 100 mmol/L組萌發(fā)種子和0 mmol/L組萌發(fā)種子差異代謝物Table 2 Differential metabolities of germinated seeds in 100 mmol/L group and 0 mmol/L group

表3 100 mmol/L組萌發(fā)種子和50 mmol/L組萌發(fā)種子差異代謝物Table 3 Differential metabolites of germinated seeds in 100 mmol/L group and 50 mmol/L group

注：黑色化合物為KEGG和文獻中發(fā)現(xiàn)。紅色和藍色化合物是本研究中鑒定的代謝物，紅色代表上調(diào)，藍色代表下調(diào)。實箭頭表示確定路徑，虛線箭頭表示可能的路徑。a為50 mmol/L處理組與對照組比較；b為100 mmol/L處理組與對照組比較；c為100 mmol/L處理組與50 mmol/L處理組比較。下同。 圖2 類黃酮和異黃酮生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathway of flavonoids and isoflavones

圖3 脂質(zhì)和有機酸的生物合成途徑Fig.3 Biosynthetic pathways of lipids and organic acids

3 討 論

3.1 脅迫種子中類黃酮和異黃酮含量的變化

脅迫種子中黃酮類化合物和異黃酮類化合物水平的總體變化表明萌發(fā)種子在鈣脅迫下存在一種普遍的代謝紊亂。黃酮類化合物是植物的次生代謝物，能夠參與植物對環(huán)境脅迫的反應(yīng)，其主要功能是由于其具有較強的抗氧化性[7]。黃酮類化合物通過抑制單線態(tài)氧、抑制產(chǎn)生活性氧(ROS)的酶、螯合可能催化ROS過渡產(chǎn)生的金屬離子、猝滅脂質(zhì)過氧化中自由基反應(yīng)的級聯(lián)以及“循環(huán)”其他抗氧化劑來清除ROS[8-13]。同時，黃酮類化合物具有較低的氧化還原電位[14]，可降低強自由基的活性。異黃酮類化合物的抗氧化性是其最重要的生物學(xué)特性之一[15]。在本研究中，與0 mmol/L Ca2+處理的種子相比，50 mmol/L Ca2+處理的種子在萌發(fā)過程中積累了更高濃度的5種黃酮類化合物和11種異黃酮化合物(圖2 a)。此外，與0 mmol/L Ca2+處理的種子相比，100 mmol/L Ca2+處理的種子在萌發(fā)過程中2種黃酮類化合物和5種異黃酮化合物表達上調(diào)(圖2 b)。但與50 mmol/L Ca2+處理相比，100 mmol/L Ca2+處理的種子，2種黃酮類化合物和9種異黃酮化合物表達量顯著下調(diào)，只有1種黃酮類化合物和2種異黃酮表達上調(diào)(圖2 c)。這些代謝物表達量的增加可能反映了萌發(fā)種子需要清除活性氧來應(yīng)對鈣脅迫。但100 mmol/L Ca2+處理的種子中這些代謝物含量的下降可能表明，高濃度的Ca2+產(chǎn)生了嚴重的滲透脅迫。

3.2 脅迫種子脂質(zhì)含量的變化

膽堿是植物合成磷脂酰膽堿的重要代謝物[16]。磷酸乙醇胺可轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺，也可甲基化生成磷酸膽堿，磷酸膽堿又可轉(zhuǎn)化為膽堿[17]。此外，膽堿經(jīng)兩步氧化后可生成甜菜堿[18]。甜菜堿具有較強的抗?jié)B性能，并具有耐受性[19]。本實驗結(jié)果顯示，與0 mmol/L Ca2+處理的種子相比，50 mmol/L Ca2+處理的種子在萌發(fā)過程中，4個磷酸膽堿化合物、4個磷酸乙醇胺化合物和1個磷脂酰膽堿化合物表達下調(diào)(圖3 a)。表明50 mmol/L Ca2+處理的種子通過合成甜菜堿，延緩了甘油磷脂的合成，維持了細胞的滲透平衡。但是，當Ca2+脅迫程度達到100 mmol/L，甘油磷脂的合成可能恢復(fù)，與50 mmol/L Ca2+處理組相比，100 mmol/L Ca2+處理的種子中2個磷酸膽堿化合物和1個磷脂酰膽堿化合物表達上調(diào)(圖3 c)。因此，在100 mmol/L Ca2+條件下，膜脂可能已被嚴重破壞，急需修復(fù)。此外，與對照組相比，50 mmol/L Ca2+處理的種子中β-sitosterol和2-linoleoylglycerol表達上調(diào)，同時，與對照和50 mmol/L Ca2+處理的種子相比，phytosphingosine表達上調(diào)(圖3 a～c)。β-sitosterol可通過提高膜穩(wěn)定性指數(shù)來緩解鹽脅迫對向日葵的傷害效應(yīng)，同時，在鹽脅迫下施用β-sitosterol可提高向日葵植株的可溶性糖和脯氨酸含量，從而部分緩解了鹽脅迫的抑制作用[20]。同時，Senthil-Kumar等[21]也報道，sitosterol可能通過增強膜穩(wěn)定性而在非生物脅迫耐受性中發(fā)揮作用。此外，2-linoleoylglycerol還有助于不飽和脂肪酸的生物合成。因此，在50 mmol/L Ca2+處理的種子中，β-sitosterol和2-linoleoylglycerol的表達上調(diào)可能具有增強膜穩(wěn)定性的作用。植物鞘脂不僅是質(zhì)膜和其他內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)成分，而且在生物和非生物脅迫中起信號分子的作用[22]。研究表明，phytosphingosine是一種天然存在的具有生物活性的鞘脂分子，外源添加phytosphingosine可快速誘導(dǎo)長鏈堿基、ROS和乙烯瞬時合成的轉(zhuǎn)錄，表明植物免疫系統(tǒng)中獲得性抗性的形成[23]。因此，phytosphingosine的增加表明phytosphingosine可能具有信號分子的功能。

3.3 脅迫種子中有機酸和其他化合物含量的變化

有機酸可以為多種生物活性和不同生物合成途徑的前體提供能量，從而在逆境條件下維持植物的細胞功能[24]。有機酸可以平衡過量的離子，調(diào)節(jié)細胞pH值和滲透電位[25-26]。此外，有研究表明，有機酸在活性氧清除和細胞完整性中發(fā)揮重要作用[27-29]。在本研究結(jié)果中，與對照相比，50 mmol/L和100 mmol/L Ca2+脅迫下的萌發(fā)種子中，citric acid，DL-malic acid，3-furancarboxylic acid的表達均下調(diào)(圖3 a～圖3 b)。檸檬酸和蘋果酸在檸檬酸循環(huán)中起重要作用，這兩種有機酸在鈣脅迫下的減少可能是由于檸檬酸循環(huán)被擾亂所致。研究表明，3-furancarboxylic acid參與螯合過程，如吡啶或吡嗪環(huán)的氮原子[30]。同時，蘋果酸可以合成3-furancarboxylic acid，說明3-furancarboxylic acid的螯合功能可能受到了間接干擾[31]。Ignacio Barrasa等[32]報道，deoxycholic acid可通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡。在本研究中，deoxycholic acid在50 mmol/L Ca2+脅迫下含量降低，但在100 mmol/L Ca2+脅迫下增加到對照水平(圖4 a～圖4 c)。結(jié)果表明，在100 mmol/L Ca2+脅迫條件下，某些嚴重損傷的細胞可被誘導(dǎo)凋亡。在干旱脅迫誘導(dǎo)下，鷹嘴豆(Cicerarietinum)耐性品系的L-isoleucine水平升高，表明鷹嘴豆對干旱脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)，提示L-isoleucine可能作為脯氨酸等代謝生物標志物[33]。Paidi等[34]報道了L-isoleucine作為滲透保護劑，在鹽脅迫下保護Aeluropus lagopoides的膜和蛋白質(zhì)免受ROS的損害。在本研究結(jié)果中，L-isoleucine在50 mmol/L Ca2+脅迫下增加顯示了類似的功能。Reduced L-glutathione在植物的許多生理過程中發(fā)揮重要作用，是細胞內(nèi)對抗氧化應(yīng)激的主要防御分子[35]。因此，50 mmol/L Ca2+脅迫下增加的Reduced L-glutathione可能具有清除ROS的作用。