趙 芝，張 剛，李哲麗，劉玉鳳，鄭少華，劉 楠

結(jié)直腸癌是現(xiàn)階段我國發(fā)病率、病死率較高的惡性腫瘤[1]。病理特征是影響結(jié)直腸癌患者治療決策、復(fù)發(fā)、預(yù)后的重要因素，因此研究影響其病理特征的分子標(biāo)志物意義重大[2-3]。微小RNA可調(diào)節(jié)機體多種細(xì)胞功能，在結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中均可檢測到微小RNA表達(dá)異常[4-5]。在體外細(xì)胞實驗中，結(jié)直腸癌細(xì)胞微小RNA-31(miR-31)表達(dá)升高，并發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌化療抗性有關(guān)，但其在人體結(jié)腸癌組織與癌旁組織中表達(dá)的研究少見，是否與病理特征有關(guān)尚不明確[6-7]。長鏈非編碼RNA母系印記基因3(LncRNA MEG3)是異源非編碼RNA，靶基因預(yù)測結(jié)果顯示LncRNA MEG3與miR-31的3' 端非翻譯區(qū)(3'UTR)存在結(jié)合位點，二者結(jié)合后可調(diào)控頭頸部腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等行為，被認(rèn)為是診斷和評估頭頸部癌癥患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。而在結(jié)直腸癌患者中，LncRNA MEG3對miR-31的靶向作用及對病理特征的影響尚無相關(guān)報道。故本研究通過檢測結(jié)直腸癌組織與癌旁組織LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)，并分別經(jīng)LncRNA MEG3過表達(dá)及抑制miR-31表達(dá)分析二者靶向調(diào)控作用及對病理特征的影響，從臨床和基礎(chǔ)細(xì)胞實驗角度，為進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌侵襲性等生物學(xué)行為提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月—2021年10月我院收治的85例結(jié)直腸癌，其中男46例，女39例；年齡44～76(57.15±6.34)歲；腫瘤直徑≤5 cm 46例，>5 cm 39例；T1期20例，T2期22例，T3期24例，T4期19例；N0期23例，N1期33例，N2期29例；M0期58例，M1期27例；低分化46例，中分化24例，高分化15例。

1.2入組標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；首次確診，既往無癌癥相關(guān)治療史；年齡>18歲；自愿簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌者；伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者；無法明確腫瘤分期者。

1.3研究方法

1.3.1主要試劑：LncRNA MEG3 mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、LncRNA MEG3抑制劑(anti-LncRNA MEG3)均購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibco公司；miR-31 siRNA(si-miR-31)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海陽光生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3.2LncRNA MEG3、miR-31檢測：取活檢或術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織、癌旁組織標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR檢測LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA，上機行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用比較閾值法定量分析數(shù)據(jù)，LncRNA MEG3以GAPDH為內(nèi)參基因，miR-31以U6為內(nèi)參基因，檢測基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長融合為60%～70%時傳代。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸浮液接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長融合至30%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，分別用anti-miR-NC、anti-LncRNA MEG3、miR-NC、LncRNA MEG3 mimic轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，并依此分為anti-miR-NC組、anti-LncRNA MEG3組、miR-NC組、LncRNA MEG3組。

1.3.4熒光素酶報告基因檢測LncRNA MEG3靶基因：利用TargetScan等靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA MEG3與miR-31 3'UTR存在結(jié)合位點，將含有LncRNA MEG3結(jié)合位點的miR-31 3'UTR片段插入熒光素酶報告基因載體，構(gòu)建WT-miR-31與MUT-miR-31 3'UTR熒光素酶報告載體。將熒光素酶報告載體WT-miR-31、MUT-miR-31分別與LncRNA MEG3 mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測SW480細(xì)胞相對熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1不同組織中LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)比較 癌組織LncRNA MEG3表達(dá)低于癌旁組織，miR-31表達(dá)高于癌旁組織(P<0.01)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者中不同組織LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)比較

2.2LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.718，P<0.01)。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者LncRNA MEG3與miR-31相關(guān)性

2.3LncRNA MEG3對miR-31的靶向調(diào)控作用觀察 為明確LncRNA MEG3是否可靶向調(diào)控miR-31表達(dá)，分別將miR-NC、LncRNA MEG3 mimic與WT-miR-31、MUT-miR-31共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，LncRNA MEG3 mimic可明顯抑制WT-miR-31的熒光素酶活性(P<0.05)，但LncRNA MEG3 mimic對MUT-miR-31的熒光素酶活性無明顯抑制作用(P>0.05)，見表2。將anti-miR-NC、anti-LncRNA MEG3分別轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR法分別檢測LncRNA MEG3過表達(dá)及沉默LncRNA MEG3表達(dá)后SW480細(xì)胞中miR-31表達(dá)變化，結(jié)果顯示LncRNA MEG3組SW480細(xì)胞中miR-31表達(dá)顯著降低，anti-LncRNA MEG3組SW480細(xì)胞中miR-31表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3。

2.4不同病理特征患者LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)比較 不同T分期、N分期、M分期、分化程度患者LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 不同病理特征結(jié)直腸癌患者LncRNA MEG3與miR-31表達(dá)比較

2.5LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與病理特征的相關(guān)性 LncRNA MEG3表達(dá)與T、N分期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.737、-0.725，P<0.01)，與分化程度呈正相關(guān)(r=0.824，P<0.01)；miR-31表達(dá)與T、N分期呈正相關(guān)(r=0.830、0.748，P<0.01)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.742，P<0.01)。見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與病理特征的相關(guān)性

3 討論

微小RNA表達(dá)異?？梢鹉[瘤等多種疾病發(fā)生，隨著生物信息技術(shù)發(fā)展，微小RNA成為腫瘤治療靶點[10]。部分微小RNA發(fā)揮促癌基因作用，其在腫瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)微小RNA表達(dá)已成為腫瘤治療研究的新方向[11]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織miR-31表達(dá)高于癌旁組織，與既往報道一致[12]，提示miR-31可能為結(jié)直腸癌促癌基因。miR-31高表達(dá)能通過靶向張力蛋白1，影響免疫浸潤，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[13]。

本研究不同T、N、M分期及分化程度患者miR-31表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且miR-31與T、N分期呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示miR-31與結(jié)直腸癌患者病理特征有關(guān)，miR-31高表達(dá)預(yù)示著更強的腫瘤侵襲性。CUI[14]研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者miR-31表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；MOLOUDIZARGARI等[15]研究顯示，miR-31是預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后的標(biāo)志物。

LncRNA MEG3能調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡等多種細(xì)胞活動，在腫瘤細(xì)胞中，因LncRNA MEG3啟動子甲基化或甲基化位點小片段缺失，造成LncRNA MEG3表達(dá)降低或基因沉默，導(dǎo)致正常細(xì)胞異常增殖發(fā)生癌變[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，癌組織LncRNA MEG3表達(dá)明顯降低，且不同病理特征患者LncRNA MEG3表達(dá)存在顯著差異，LncRNA MEG3與T分期、N分期呈負(fù)相關(guān)，與分化程度呈正相關(guān)，提示LncRNA MEG3在結(jié)直腸癌中起抑癌基因作用。LncRNA MEG3高表達(dá)能修復(fù)DNA損傷，保護(hù)內(nèi)皮功能[17]。沉默LncRNA MEG3可導(dǎo)致Nocth信號通路活化，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡，揭示LncRNA MEG3的抑癌作用[18]。

CHEN等[19]報道，LncRNA MEG3是通過海綿化miR-421抑制口腔癌干細(xì)胞的自我更新和侵襲能力。XU等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3通過海綿化miR-147抑制細(xì)胞的增殖、遷移。可見LncRNA MEG3在腫瘤中的抑癌作用可通過調(diào)控微小RNA來實現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，抑制LncRNA MEG3后，結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中miR-31表達(dá)升高，LncRNA MEG3過表達(dá)后結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中miR-31表達(dá)降低，行熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3可特異性結(jié)合miR-31，負(fù)向調(diào)控miR-31表達(dá)，并進(jìn)一步影響結(jié)直腸癌患者病理特征，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上，結(jié)直腸癌組織中LncRNA MEG3呈低表達(dá)，miR-31呈高表達(dá)，且LncRNA MEG3可特異性結(jié)合miR-31，負(fù)向調(diào)控miR-31表達(dá)，影響結(jié)直腸癌患者病理特征，可為揭示結(jié)直腸癌侵襲性、靶向治療等提供新思路。