孟 濤，陳 劍，杜佳琳，逄 璐，李海霞，許 冬

北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034

參考區(qū)間是指健康個體中95%測量值的分布范圍[1]，是疾病診斷與健康狀況評估的標(biāo)準(zhǔn)。由于地域分布、種族、性別、年齡、生活習(xí)慣以及檢測方法等多方面的差異，實驗室應(yīng)該建立適合所服務(wù)人群的參考區(qū)間，或者對已有的參考區(qū)間進(jìn)行驗證。美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)和國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)發(fā)布的指南EP28-A3c中[2]，推薦建立本實驗室的參考區(qū)間，但大多數(shù)實驗室很難完成該項工作，因此建議通過以下兩種方法來實現(xiàn)：(1)實驗室收集20個健康個體的樣本來驗證參考區(qū)間，該參考區(qū)間的建立是用更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)建立的；(2)可以通過CLSI-EP09文件來轉(zhuǎn)移驗證參考區(qū)間，但前提條件是測定結(jié)果有可比性，分析結(jié)果高度相關(guān)。目前我國成年人慢性腎臟病(CKD)的患病率為10.8%，兒童CKD患病率為(14.9～118.9)/100萬,不同研究之間存在較大差異，且多項研究發(fā)現(xiàn),隨著年齡增大該病發(fā)病率逐漸升高[3]。由于兒童肌酐參考區(qū)間明顯不同于成人，因此建立適合不同性別和年齡組的兒童肌酐參考區(qū)間在兒童CKD的診斷和治療中有重要意義。目前檢測肌酐常用的方法主要有堿性苦味酸法和肌氨酸氧化酶法(簡稱苦味酸法和酶法)，研究顯示這兩種方法間存在一定的差異[4]。本文研究目的在于通過檢測一定數(shù)量的標(biāo)本，建立酶法和苦味酸法檢測肌酐水平的相關(guān)性，從而利用轉(zhuǎn)移法將《兒童臨床常用生化檢驗項目參考區(qū)間：WS/T 780-2021》(以下簡稱為WS/T 780-2021)推薦的兒童肌酐參考區(qū)間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，建立苦味酸法檢測兒童肌酐水平的參考區(qū)間，同時利用醫(yī)院LIS大數(shù)據(jù)以及Hoffmann方法間接建立本地區(qū)兒童肌酐水平的參考區(qū)間，進(jìn)一步用間接法建立的參考區(qū)間來驗證轉(zhuǎn)移后參考區(qū)間的適用性，評估兩種方法參考區(qū)間的差異[5-7]。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1轉(zhuǎn)移法標(biāo)本的收集 收集2022年1月就診于本院的CKD患兒的新鮮剩余血清，要求標(biāo)本無溶血、黃疸、脂血，肌酐水平小于150 μmol/L，共收集305份血清標(biāo)本，分別采用WS/T 780-2021[8]推薦的酶法和苦味酸法對肌酐水平進(jìn)行檢測。

1.1.2間接法數(shù)據(jù)的處理 利用醫(yī)院LIS選取2018年1月至2021年12月本院收治的18歲以下89 916例兒童肌酐水平的檢測結(jié)果，剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非兒科門診患者；(2)存在脂血、溶血、黃疸等的異常標(biāo)本；(3)蛋白尿、血尿及其他腎臟病患者；(4)無性別、姓名、年齡的患者；(5)國籍為非中國籍患者；(6)標(biāo)本種類為非血清的患者；(7)同一患者多次檢測肌酐時，第1次檢測結(jié)果后的其他結(jié)果；(8)年齡<28 d或>18歲的患者。最終經(jīng)篩選后獲得24 450例兒童肌酐水平檢測結(jié)果。

1.2儀器及試劑 酶法：羅氏Cobas702，配套酶法肌酐檢測試劑(批號577466)、羅氏生化多項校準(zhǔn)品(批號499017)?？辔端岱ǎ贺惪寺鼛鞝柼谹U5800，配套苦味酸法肌酐檢測試劑(批號2634)、貝克曼生化多項校準(zhǔn)品(批號11220)。質(zhì)控品為朗道HUMAN ASSAYEDMULTI-SERA(批號1285UN、1006UE)。質(zhì)控規(guī)則采用Westgard多規(guī)則(12s、13s、22s和R4s)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，累計變異系數(shù)(CV)均在設(shè)定的范圍之內(nèi)，室間質(zhì)評均合格。

1.3方法

1.3.1轉(zhuǎn)移法建立參考區(qū)間 將收集的305份新鮮血清分別用酶法和苦味酸法對肌酐水平進(jìn)行檢測，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，剔除明顯偏倚數(shù)據(jù)，剩余292份有效數(shù)據(jù)采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析，得到酶法與苦味酸法檢測肌酐水平的回歸方程，將其代入WS/T 780-2021推薦的兒童肌酐參考區(qū)間[8]，從而得到轉(zhuǎn)換后的兒童肌酐水平參考區(qū)間。

1.3.2間接法建立參考區(qū)間 采用SPSS19.0軟件中的 Kolmogorov-Smirnov檢驗對24 450例兒童肌酐數(shù)據(jù)進(jìn)行分層并進(jìn)行正態(tài)性分析，對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)利用BLOM公式進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換，將轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)采用Tukey法[9]計算25%和75%的百分位數(shù)的值(P25，P75)及四分位間距(IQR)(P75～P25)，剔除(P25-1.5×IQR)～(P75+1.5×IQR)以外的數(shù)據(jù)，再將篩選后的數(shù)據(jù)重復(fù)按照Tukey法進(jìn)行離群值篩選，直至所有數(shù)據(jù)均落在上、下臨界值內(nèi)為止。剔除后的正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，利用Hoffmann法將取得的數(shù)據(jù)線段上2.5%和97.5%作為該項目的參考區(qū)間。

1.3.3參考區(qū)間驗證 參考變化值(RCV)是利用室內(nèi)質(zhì)控變異數(shù)據(jù)，結(jié)合健康者和患者體內(nèi)生物學(xué)變異數(shù)據(jù)計算得出，利用公式RCV=21/2×Z×(CVa2+CVi2)1/2計算得到肌酐的RCV[10]，收集2018-2021年內(nèi)兩個水平(水平1、水平2)室內(nèi)質(zhì)控的年度CV，計算出中位數(shù)CV作為分析變異CVa，查詢肌酐在健康人群中變異CVi(https://www.westgard.com/biodatabasedisease.htm)，Z值為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的臨界值，取95%置信區(qū)間(Z=1.96)，利用公式比較兩種方法獲得的參考區(qū)間之間的偏倚是否在RCV的范圍之內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)移法回歸方程的建立 利用305份血清的肌酐水平檢測結(jié)果，剔除離群值后建立兩種方法檢測肌酐水平的回歸方程，計算公式為Y=0.930 8X+7.639 9，R2=0.990 3(Y=苦味酸法檢測的肌酐水平，X=酶法檢測的肌酐水平)。

2.2苦味酸法檢測的肌酐水平參考區(qū)間和轉(zhuǎn)移后參考區(qū)間差異比較 間接法建立的參考區(qū)間與轉(zhuǎn)移法建立的參考區(qū)間見表1。結(jié)果顯示，隨著年齡增加，肌酐參考區(qū)間上下限也隨之增加，13歲之后的同年齡段男性與女性肌酐參考區(qū)間上下限有較大差異，呈增加趨勢，與兒童生長發(fā)育特點相符合。間接法與轉(zhuǎn)移法所確定的參考區(qū)間上下限在不同年齡和性別分組的相對偏倚較小。

表1 間接法建立的肌酐參考區(qū)間與轉(zhuǎn)移法建立的肌酐參考區(qū)間的差異比較

2.3確認(rèn)兩種方法建立的參考區(qū)間偏倚 利用RCV值驗證參考區(qū)間，根據(jù)實驗室2018-2021年肌酐的年度CV，計算得CVa=2.5%，見表2。通過查詢數(shù)據(jù)庫得到肌酐的CVi=4.3%，計算RCV=13.8%。從間接法建立的參考區(qū)間和轉(zhuǎn)移法建立的參考區(qū)間上下限的的相對偏倚可以看出，除16～18歲男性肌酐上限的相對偏倚為-17.9%，其絕對值超過了肌酐的RCV外，其余結(jié)果均在13.8%以內(nèi)，滿足參考區(qū)間驗證的要求。為進(jìn)一步驗證16～18歲男性肌酐參考區(qū)間是否適合本地區(qū)人群，從LIS數(shù)據(jù)庫中篩選出2018-2021年16～18歲體檢男性數(shù)據(jù)67條，剔除1例明顯異常數(shù)據(jù)，共有5條數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)換后的參考區(qū)間56～102 μmol/L之外，未通過比例為7.6%(<10%)，滿足EP28-A3c中關(guān)于參考區(qū)間驗證數(shù)據(jù)大于20例時，參考區(qū)間以外數(shù)據(jù)<10%的要求，驗證通過。

表2 2018-2021年實驗室肌酐年累計CV(%)

3 討 論

CLSI指南中對于參考區(qū)間建立時參考個體的選擇有兩種方式，一種方式稱之為先驗，即為標(biāo)準(zhǔn)的參考個體篩選方式，通過納入嚴(yán)格的排除標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過正規(guī)評價、表觀調(diào)查篩選出合適的參考人群；另一種方式稱之為后驗，即從參加健康體檢、疾病預(yù)防或者雖患病但證明對研究項目沒有影響的非健康人群中獲取大量的已進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢驗的人群數(shù)據(jù)，通過預(yù)設(shè)的排除標(biāo)準(zhǔn)獲得參考個體[2]，后驗的優(yōu)勢在于較便捷的獲取大量的相關(guān)數(shù)據(jù)，節(jié)省人力物力，不足之處在于所獲得的數(shù)據(jù)較先驗方式會存在一定的偏倚，間接法參考區(qū)間的建立就是來自后驗方式。

實驗室引用某一項目的參考區(qū)間，需要經(jīng)過生物參考區(qū)間的綜合評估及選擇、驗證、臨床評審后，才能應(yīng)用于臨床。在選擇參考區(qū)間時，應(yīng)根據(jù)實驗室的檢測體系、質(zhì)量要求以及適用人群，選擇適合本實驗室的參考區(qū)間。當(dāng)實驗室檢測系統(tǒng)及適用人群與所選參考區(qū)間有差異時，在滿足所引用參考區(qū)間建立時的分析系統(tǒng)與實驗室使用相同或具有可比性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或校準(zhǔn)物質(zhì)，有相近的不精密度、干擾，報告單位及方法學(xué)比較試驗在可接受的范圍內(nèi)時，可以將所引用的參考區(qū)間轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有的分析系統(tǒng)。用回歸方程來檢驗兩者的關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)為線性關(guān)系擬合較好(r>0.90)且沒有高階項存在(比如沒有二次方項X2)時，可以用回歸模型來實現(xiàn)參考區(qū)間上下限的轉(zhuǎn)移[11]。EP28-A3c中關(guān)于參考區(qū)間的驗證，明確規(guī)定對于每一分層數(shù)據(jù)選用20例健康個體進(jìn)行驗證，3例及以上(>10%)超出范圍則需要重新選擇20例再進(jìn)行驗證，再次驗證失敗則證明此參考區(qū)間不適用于本實驗室，需要重新選擇或自建參考區(qū)間。這里需要關(guān)注的是如果提供的參考區(qū)間過寬，那么使用20個值進(jìn)行驗證，大概率會落入到參考區(qū)間內(nèi)，這時就需要較大的樣本量(如40個)或重復(fù)驗證來減少落入?yún)⒖紖^(qū)間內(nèi)的概率[2]。實驗室獲得的參考區(qū)間還需要經(jīng)過臨床評審，來驗證是否能滿足臨床需要。

酶法和苦味酸法是檢測肌酐水平的主要方法，這兩種檢測方法在檢驗領(lǐng)域應(yīng)用范圍很廣，在臨床應(yīng)用中各有其優(yōu)缺點：影響酶法檢測肌酐水平的干擾物質(zhì)主要有羥苯磺酸鈣、酚磺乙胺、膽紅素、維生素C等，影響苦味酸法檢測肌酐水平的干擾物質(zhì)主要是維生素C、蛋白質(zhì)、丙酮酸以及頭孢唑啉、青霉素G等抗菌藥物[12]，對于常用這些藥物的人群應(yīng)尤其關(guān)注其對于肌酐水平的影響。WS/T 780-2021中明確指出，兒童肌酐水平檢測方法為酶法，計量學(xué)溯源到同位素稀釋質(zhì)譜法[8]，本院對兒童肌酐水平的檢測方法為苦味酸法，與酶法的溯源一致，故可以轉(zhuǎn)移參考區(qū)間。從轉(zhuǎn)移后的回歸方程可以看出，兩者的線性關(guān)系較好，滿足兩個系統(tǒng)間轉(zhuǎn)移的條件，轉(zhuǎn)移后的參考區(qū)間經(jīng)過驗證滿足要求。EP28-A3c指南中指出，通過建立嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取合適及足量的參考個體是建立生物參考區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn)方法(直接法)，同時指南中允許利用間接法建立參考區(qū)間。利用間接法建立參考區(qū)間，可以充分利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)，運(yùn)用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法對醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中合適的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換，剔除離群值，建立不同性別、年齡的生物參考區(qū)間。雖然利用LIS獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過了嚴(yán)格的篩選，但仍然會存在一定數(shù)量的離群值，但相關(guān)研究證實，即使在30%偏態(tài)數(shù)據(jù)的干擾下，其對最終結(jié)果的影響較小[13]。

本文通過對比研究驗證了轉(zhuǎn)移法建立參考區(qū)間的可行性，為難以獲得標(biāo)本的人群，如新生兒、嬰幼兒、老年人等血液指標(biāo)參考區(qū)間的建立提供了一種較為可行的方法，當(dāng)實驗室不能直接引用或建立參考區(qū)間時，在滿足所服務(wù)人群及實驗室分析系統(tǒng)具有可比性的前提下，可考慮采用參考區(qū)間轉(zhuǎn)移的方式，獲得適合本實驗室的參考區(qū)間。轉(zhuǎn)移的對象可以是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、說明書或者實驗室之前建立的參考區(qū)間，但該方法不是參考區(qū)間建立的推薦方法，而是僅適用于上述特殊情況下的替代方法。通過間接法獲得的參考區(qū)間驗證轉(zhuǎn)移法參考區(qū)間，比較兩種方法的相對偏倚，以參考變化值作為驗證是否通過的依據(jù)，兩者結(jié)果相近，轉(zhuǎn)移后的參考區(qū)間可用于本實驗室。

本研究中，采用間接法計算所得16～18歲男性肌酐水平參考區(qū)間下限較轉(zhuǎn)換后參考區(qū)間下限相對偏倚較大，原因可能與該年齡段收集的數(shù)據(jù)較少有關(guān)，可適當(dāng)擴(kuò)大數(shù)據(jù)量，重新驗證。本研究不足之處在于僅采用本院數(shù)據(jù)，可能具有一定的局限性，且13～18歲數(shù)據(jù)偏少，仍需要增加檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。經(jīng)過與臨床醫(yī)生咨詢和溝通，結(jié)合臨床經(jīng)驗與實際情況分析，臨床普遍認(rèn)同轉(zhuǎn)移后的參考區(qū)間可以作為本地區(qū)兒童肌酐水平參考區(qū)間。

綜上所述，經(jīng)間接法驗證，轉(zhuǎn)移法建立的兒童肌酐水平參考區(qū)間符合要求，可作為實驗室本地區(qū)兒童肌酐水平的參考區(qū)間。