張 穎，金艷文，溫 艷，李偉偉

河北省承德市婦幼保健院：1.檢驗科；2.產(chǎn)科，河北承德 067000；3.河北省秦皇島市婦幼保健院遺傳優(yōu)生科，河北秦皇島 066000

胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)異常是最常見的胎兒先天畸形之一，其檢出率約為1%[1]。胎兒CNS異常的病因和機制尚不清楚。相關(guān)研究顯示，大約 40% 的致病因素可能是環(huán)境和遺傳因素[2]。胎兒CNS異常的臨床表現(xiàn)包括：輕度腦室擴大、后顱窩增寬、腦積水、胼胝體發(fā)育不全(ACC)和前腦無裂畸形等。隨著產(chǎn)前超聲的發(fā)展，大多數(shù)胎兒CNS異常均可經(jīng)產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)[3]。通常建議超聲異常的胎兒進行侵入性產(chǎn)前診斷，以確定其是否存在遺傳異常，確定可能的病因，并評估胎兒的預(yù)后。傳統(tǒng)的核型分析是診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，然而卻很難確定染色體微缺失和使用核型分析進行微重復(fù)，且需要長時間的細(xì)胞培養(yǎng)。染色體微陣列分析(CMA)因其提供的高分辨率而越來越多地被用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因診斷，例如自閉癥、智力障礙、發(fā)育遲緩、流產(chǎn)或產(chǎn)前診斷。目前國外指南建議當(dāng)超聲檢測到胎兒存在一個或多個結(jié)構(gòu)異常時，用 CMA 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的核型分析[4-5]。CMA技術(shù)分為比較基因組雜交芯片和單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(SNP-array)兩種類型，均可以檢測染色體微缺失和微重復(fù)。SNP-array不僅可以檢測基因組拷貝數(shù)變異(CNV)，還可以檢測單親二倍體和嵌合體[6-7]。本研究應(yīng)用全基因組SNP-array聯(lián)合染色體核型分析，探討二者聯(lián)合應(yīng)用在胎兒CNS異常產(chǎn)前診斷中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018-2020年到河北省承德市婦幼保健院和秦皇島市婦幼保健院進行胎兒CNS異常產(chǎn)前診斷的患者275例。入組患者的孕周為13～39周，平均(26.21±7.84)周；年齡20～45歲，平均(32.44±7.83)歲；單純性CNS異常組163例，CNS異常合并其他異常組112例。單純性CNS異常指超聲異常僅局限于CNS；CNS異常合并其他異常意味著胎兒除CNS異常外，心臟、泌尿、消化和其他系統(tǒng)也存在異常。單純CNS異常163例，其中輕度腦室擴大62例，腦積水19例，后顱窩增寬10例，ACC 15例，蛛網(wǎng)膜囊腫16例，脈絡(luò)叢囊腫 15例，小頭畸形3例，室管膜下囊腫17例，小腦發(fā)育不全2例、脊柱畸形2例、沃二氏綜合征1例、腦膨出1例。所有入組患者均為單胎妊娠，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2染色體核型分析 根據(jù)兩個醫(yī)院建立的常規(guī)方法，對275例CNS異常胎兒的絨毛、羊水、臍帶血標(biāo)本進行培養(yǎng)、收集、制備、G顯帶。采用GSL-120自動染色體掃描平臺(Applied Imaging公司)對制備的樣品進行采集分析。如疑為嵌合體或異常核型，則加倍計數(shù)，不少于 50 個分裂相。

1.3SNP基因分型芯片 使用Affymetrix公司的CytoScan 750k芯片和Illumina試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行基因組DNA擴增、雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析。結(jié)果參考DGV(http://projects.tcag.ca/variation)、ISCA(https://www.iscaconsortium.org/)、OMIM(http://www.omim.org)、DECIPHER(htts://decinher.sanger.ac.uk/)等數(shù)據(jù)庫。根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)將結(jié)果分為CNVs異常、臨床意義不明CNVs(VUS)和致病性CNVs。在CNVs異常的情況下，還對親代樣本進行檢測，以確定變異的遺傳性質(zhì)及其臨床意義。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1染色體核型分析結(jié)果 275例CNS異常胎兒中，有22例胎兒有致病性染色體異常，異常率為8.00%(22/275)，包括13-三體(3例)、18-三體(7例)、21-三體(5例)、其他染色體數(shù)目異常(1例)、染色體結(jié)構(gòu)異常(6例)。單純性CNS 異常的染色體異常率為4.91%(8/163)，CNS異常合并其他異常的染色體異常率為 12.50%(14/112)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 胎兒CNS異常中的致病性染色體異常分析

2.2SNP-array分析 275例CNS異常胎兒采用SNP-array分析，除了染色體核型異常的22例胎兒之外(CNVs的結(jié)果與核型一致)，另檢測出23例CNVs異常胎兒，檢出率為8.36%(23/275)，其中致病性CNVs 15例，VUS 9例。163例單純性CNS異常胎兒中，CNVs異常10例，其中致病性CNVs 7例，VUS 3例。112例CNS異常合并其他異常胎兒中CNVs異常13例，其中致病性CNVs 8例，VUS 5例。單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組致病性CNVs檢出率分別為4.29%(7/163)和7.14%(8/112)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CNS異常合并其他異常組的CNVs異常檢出率為11.61%(13/112)，高于單純性CNS異常組的6.13%(10/163)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3～6。

表2 單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組中染色體異常情況(n)

表3 染色體異常胎兒SNP-array結(jié)果

表4 單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組CNVs檢出情況[n(%)]

表5 CNS異常胎兒中致病性CNVs的SNP-array結(jié)果

表6 CNS異常胎兒中VUS的SNP-array結(jié)果

2.3染色體異常和致病性CNVs在單純性CNS異常組中的檢出率 單純性CNS異常組胎兒中染色體異常(8例)和致病性CNVs(7例)的檢出率為9.20%(15/163)。脈絡(luò)叢囊腫(16.00%)、室管膜下囊腫(17.67%)和脊柱畸形(50.00%)的染色體異常和致病性CNVs檢出率高于其他類型，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。單純性CNS異常組胎兒中以輕度腦室擴大最多，占38.04%(62/163)，其中染色體異常和致病性CNVs占6.45%(4/62)，見表7。

表7 163例單純性CNS胎兒的表型特征

2.4臨床結(jié)局 在275例CNS異常胎兒中，245例成功隨訪，剩余病例未能隨訪成功的原因包括患者拒絕隨訪、失聯(lián)等。除染色體異常(22例)、致病性CNVs(15例)和VUS(8例)的胎兒被終止妊娠，另外有28例胎兒其核型分析和SNP-array結(jié)果顯示正常，但仍然終止妊娠。

3 討 論

遺傳是導(dǎo)致胎兒發(fā)生CNS異常最主要的因素[8]，CNS異?？蓪?dǎo)致胎兒腦脊液紊亂、左心室變形或者擴張，并且有極大概率導(dǎo)致胎兒多個腦室的異常改變[5]。胎兒CNS異常多數(shù)預(yù)后不良，且致殘性高。目前通過產(chǎn)前超聲篩查、遺傳分析和臨床咨詢，可以評估CNS異常胎兒的預(yù)后[9]。嚴(yán)重畸形和染色體異常的胎兒可以及時終止妊娠，有效控制嚴(yán)重畸形胎兒的出生率，對指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育、減少出生缺陷、提高新生兒人口素質(zhì)具有重要的臨床意義。本研究對伴或不伴其他超聲異常的CNS異常胎兒進行染色體核型分析和SNP-array聯(lián)合檢測。染色體核型分析檢出22例異常核型，染色體異常檢出率為8.00%，這說明非整倍體和大片段染色體的異常會引起遺傳的改變，擾亂基因間的平衡，從而導(dǎo)致胎兒多系統(tǒng)畸形。除了22例染色體核型異常(CNVs的結(jié)果與核型一致)，SNP-array另檢測到23例異常CNVs，其檢出率為16.36%(45/275)。本次研究中的23例異常CNV片段的缺失或者微重復(fù)大小不同，傳統(tǒng)的核型分析無法識別。研究表明，胎兒CNS異常的病因除了與染色體異常有關(guān)外，還與染色體微缺失和/或微重復(fù)有關(guān)[10]。SNP-array的使用可以彌補傳統(tǒng)核型分析的不足，對于核型分析正常的胎兒出現(xiàn)CNS異常，應(yīng)建議采用SNP-array進行進一步檢測。染色體核型分析需要進行細(xì)胞培養(yǎng)，耗時長，另外需要具有經(jīng)驗的分析人員對染色后的標(biāo)本進行計數(shù)，檢測的周期較長，而且由于培養(yǎng)失敗等問題易導(dǎo)致無法檢測。SNP-array是一種基因芯片技術(shù)，屬于CMA，與傳統(tǒng)的核型技術(shù)相比具有更高的分辨率，可識別Kb水平的微缺失和微重復(fù)。SNP-array技術(shù)可額外發(fā)現(xiàn)6%～15%的染色體結(jié)構(gòu)異常[11]。由于SNP-array技術(shù)不需要進行細(xì)胞培養(yǎng)，在臨床的應(yīng)用越來越廣泛，尤其對于一些傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷染色體核型分析無法檢測到的亞微結(jié)構(gòu)CNVs的診斷很有價值[12]。

CNS異常合并其他異常組的CNVs異常檢出率高于單純性CNS異常組(11.61%和6.13%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，對于有CNS異常表現(xiàn)的胎兒，特別是有多種CNS異常表現(xiàn)的胎兒，建議使用染色體核型和SNP陣列聯(lián)合檢測進行最終診斷。單純性CNS異常組的染色體異常和致病性CNVs的檢出率為9.20%。脈絡(luò)叢囊腫、室管膜下囊腫和脊柱畸形的染色體異常和致病性CNVs檢出率高于其他單純性CNS異常胎兒。既往研究也表明，在通過CMA檢測致病性CNVs的情況下，單純性CNS異常胎兒的額外檢出率為6.5%～8.3%，而這是傳統(tǒng)的核型分析所不能檢測的[13-14]。SNP-array檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)的23例CNVs異?；颊咧?，15例為致病性CNVs，其中有7例是大眾熟知的微缺失/微重復(fù)綜合征，5例16p11.2和2例22q11.2微缺失綜合征。本研究中經(jīng)SNP-array發(fā)現(xiàn)的5例16p11.2微缺失綜合征有著不同的超聲異常表現(xiàn)，輕度腦室擴大1例，腦積水、脊柱畸形、腦膨出各1例，其余1例除輕度腦室擴大外還有其他的超聲異常。16p11.2微缺失綜合征的發(fā)病率約為0.3%[15]，主要臨床癥狀包括智力障礙和自閉癥譜系障礙。T-box轉(zhuǎn)錄因子6是導(dǎo)致16p11.2微缺失綜合征患者椎體畸形的關(guān)鍵基因[1]。目前，關(guān)于16p11.2微缺失綜合征胎兒的報道很少，只有少數(shù)研究報道了與16p11.2微缺失綜合征相關(guān)的超聲異常，包括心臟畸形、多囊腎、鼻骨缺失、單臍動脈、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等[16]。本研究經(jīng)SNP-array 發(fā)現(xiàn)的2例22q11.2微缺失綜合征均為脈絡(luò)叢囊腫，只是其中1例除此之外表現(xiàn)了其他的超聲異常。22q11.2微缺失綜合征的發(fā)病率約為1/4 000,臨床癥狀表現(xiàn)不一。本研究經(jīng)SNP-array 還檢測到1例17號染色體的p13.3p13.2 5.2M的缺失，這個缺失可導(dǎo)致Miller-Dieker綜合征即無腦回畸形綜合征，其發(fā)病率為1.2/100 000，通常的臨床特征為ACC、小頭畸形等。本研究中該病例的超聲顯示輕度腦室擴大、小腦發(fā)育不全和其他超聲異常。

雖然SNP-array技術(shù)能夠提高CNS異常胎兒的致病性遺傳性變異的檢出率，但是這種檢測技術(shù)即CMA有其自身的不足，例如檢測出的VUS病例使遺傳咨詢變得困難。根據(jù)文獻報道[17]，CMA對VUS的檢出率為1.1%～6.0%。本研究中的275例CNS異常病例中，共有8例 VUS病例，包括單純性CNS異常以及CNS異常合并其他異常，VUS在CNS異常中的檢出率為2.91%，與以往報道檢出率呈一致性。本研究中檢測到的VUS病例中，有4例含有神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的易感基因，包括1例15q13.3重復(fù)、1例16p13.11重復(fù)、1例1q21.1q21.1重復(fù)、1例1q21.1缺失。神經(jīng)發(fā)育的易感位點外顯不全，可能表現(xiàn)為心血管疾病、認(rèn)知障礙、行為障礙和智力障礙等[18]。神經(jīng)發(fā)育的易感位點外顯率不完全使產(chǎn)前遺傳咨詢面臨極大挑戰(zhàn)。而3p22.1缺失則僅包含1～3個OMIM基因，這些變異與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育無關(guān)，但超過了報告閾值。而18q11.2重復(fù)則包含了PIGN基因的16-31外顯子，純合突變導(dǎo)致多發(fā)性先天性abnormalities-hypokalemia-epilepsy綜合征，臨床表現(xiàn)為運動發(fā)育障礙、癲癇、多種畸形和各種先天性異常包括心臟、泌尿系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)[19-20]。因此近年來，下一代測序重點研究單基因突變檢測[21]，以為更好地評估胎兒預(yù)后提供更全面的方法。

本研究將核型分析與SNP-array相結(jié)合，可以幫助CNS異常胎兒的父母做出是否終止妊娠的決定。例如，在輕度腦室擴大的胎兒中，來自SNP-array陣列的正常結(jié)果表明胎兒可能有更好的預(yù)后，父母可以選擇繼續(xù)妊娠。在本研究成功隨訪的245例患有CNS異常的胎兒中，除外染色體異常和致病性CNVs的胎兒之外，另有28例患兒其核型和SNP-array結(jié)果顯示正常，但仍然終止妊娠。所以即使核型和SNP-array結(jié)果正常，大多數(shù)胎兒CNS異常和多種畸形的父母仍然決定終止妊娠，因為他們認(rèn)為這些異常的畸形或者疾病在產(chǎn)后得不到較好的治療，出生后胎兒會具有嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，如嚴(yán)重畸形、智力障礙等。與傳統(tǒng)的核型分析相比，單核苷酸多態(tài)性陣列可以在CNS異常的胎兒中發(fā)現(xiàn)更多的CNVs異常[22]。

綜上所述，染色體核型分析為是否存在染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異提供重要的實驗依據(jù)，但其最大的不足在于細(xì)胞培養(yǎng)失敗與母體細(xì)胞污染等問題出現(xiàn)的概率較高，再加上無法檢測染色體的微缺失/微重復(fù)，需要聯(lián)合SNP-array檢測進一步確定。SNP-array檢測結(jié)果包括拷貝數(shù)變異、微缺失/微重復(fù)、染色體非整倍體數(shù)目異常、三倍體、單親二倍體、雜合性丟失、嵌合體等，可以獲得更精準(zhǔn)的遺傳信息，利于產(chǎn)前咨詢，但是其劣勢則是該檢測方法價格昂貴，提高了臨床推廣的難度，希望后期可以降低價格以發(fā)揮其更大的優(yōu)勢。盡管如此，仍建議將SNP-array用于CNS異常胎兒的產(chǎn)前診斷，可以更好地進行產(chǎn)前評估和遺傳咨詢，并發(fā)揮聯(lián)合檢測的優(yōu)勢。