李燕明，王翠峰，任美英

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014010

胸腔積液是臨床上常見(jiàn)的癥狀。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥刺激以及循環(huán)障礙等病理狀況是引起胸腔積液的主要病因[1]。近年來(lái)積液的診斷方法包括了影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查。胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)是目前臨床上最常用來(lái)診斷惡性胸腔積液(MPE)的實(shí)驗(yàn)室方法，其特異度可高達(dá)89%～98%，但因受多種因素影響，靈敏度只有40%～80%[2]，假陰性率為31.5%[3]。探尋彌補(bǔ)其不足之處的新胸腔積液診斷靶標(biāo)勢(shì)在必行。有研究表明，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-真核啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1 )/核糖體蛋白S6激酶1(p70S6K1)信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[4]。本研究從分子水平探討該信號(hào)通路在良惡性胸腔積液中的表達(dá)差異，期待為MPE的發(fā)生機(jī)制及診療靶標(biāo)研究提供新思路、新方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2020年1月至2021年1月符合病例納入標(biāo)準(zhǔn)及試驗(yàn)要求的131例胸腔積液標(biāo)本。通過(guò)患者的臨床資料結(jié)合胸膜活檢病理結(jié)果或胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合免疫組化結(jié)果，明確上述131例積液的良、惡性質(zhì)后，從中選取44例良性胸腔積液(BPE)標(biāo)本為良性對(duì)照組，44例MPE標(biāo)本為惡性測(cè)定組。惡性測(cè)定組中男22例，女22例；年齡23～80歲，中位年齡73歲；肺癌32例，乳腺癌5例，消化道腫瘤4例，淋巴瘤2例，膀胱癌1例。良性對(duì)照組中男32例，女12例；年齡18～75歲，中位年齡70歲；肺炎旁積液22例，結(jié)核性胸膜炎11例，充血性心力衰竭11例。惡性測(cè)定組與良性對(duì)照組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)、Western-blot檢測(cè)。

病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確認(rèn)有胸腔積液的患者；(2)所有患者均經(jīng)病理及臨床資料診斷明確；(3)既往未經(jīng)過(guò)放療及化療的患者；(4)病例資料無(wú)遺漏的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷不明的胸腔積液標(biāo)本；(2)患者胸腔積液病因復(fù)雜，合并多種疾病者。

病例分組標(biāo)準(zhǔn)：(1)良性對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)。肺炎旁胸腔積液的診斷標(biāo)準(zhǔn)為肺膿腫、肺炎和感染引起的胸腔積液。結(jié)核性胸膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為胸膜涂片檢出抗酸桿菌和結(jié)核分枝桿菌，胸膜活檢病理檢查結(jié)果顯示為結(jié)核引起的胸腔積液。充血性心力衰竭所引起的胸腔積液只能依據(jù)患者的病史、體征、心電圖、超聲心動(dòng)圖等輔助檢查來(lái)診斷。(2)惡性測(cè)定組入組標(biāo)準(zhǔn)：在胸腔積液脫落細(xì)胞中找到惡性腫瘤細(xì)胞，或在胸膜活檢組織中看到惡性腫瘤細(xì)胞的病理變化。

1.2主要試劑和儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；Western blot相關(guān)抗體[GAPDH、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、4EBP1、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、p70S6K1、磷酸化p70S6K1(p-p70S6K1)兔多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，Cell Signaling公司]；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(包含BSA標(biāo)準(zhǔn)品)、牛血清清蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司)。液基薄層制片機(jī)(中國(guó)湖北德里森實(shí)業(yè)有限公司)、RT-PCR分析儀(Applied Biosystems 7900 Fast)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 收集符合要求的胸腔積液40 mL，分別置于2支試管中，每支20 mL。以2 000 r/min離心5 min，保存沉渣并標(biāo)記。放置于-80 ℃冰箱中，用于RT-qPCR及Western blot檢測(cè)。

1.3.2提取總RNA (1)向分裝處理好的標(biāo)本中加入500 μL細(xì)胞裂解液和10 μL ProteinaseK，室溫下靜置15 min。4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，保留上清液并將其轉(zhuǎn)入基因組去除柱中。(2)將基因組去除柱離心2 min，留取濾液。(3)向?yàn)V液中加入70%乙醇(加入體積與上清液相同)，將其混勻，將處理好的混合液轉(zhuǎn)入RNase Free吸附柱中，經(jīng)12 000 r/min離心2 min后將廢液倒掉。(4)將500 μL蛋白去除液加入吸附柱中，高速離心2 min，倒出廢液。(5)將500 μL沖洗液加入吸附柱中，室溫條件下靜置5 min，離心2 min，丟棄廢液，再次沖洗離心一遍。(6)將吸附柱在室溫下靜置2 min晾干。(7)將吸附柱轉(zhuǎn)移入RNA收集管中，滴加30 μL RNase-Free ddH2O，靜置5 min后在12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。(8)分光光度法檢測(cè)RNA濃度。

1.3.3逆轉(zhuǎn)錄 (1)RNA變性：50 ℃放置2 min，置于冰上冷卻；(2)逆轉(zhuǎn)錄：95 ℃、1 min，結(jié)束后將cDNA保存于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR (1)引物：β-actin上游，5′-TCC CTG GAG AAG AGC TAC GA-3′；下游，5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。mTOR上游，5′-CGC TGT CAT CCC TTT ATC G-3′；下游，5′-ATG CTC AAA CAC CTC CAC C-3。4EBP1上游，5′-CAA GGG ATC TGC CCA CCA TT-3′；下游，5′-ACA CGA TGG CTG GTG CTT TA-3′。p70S6K1上游，5′-AAG GGG GCT ATG GAA AGG CAA-3′；下游，5′-TTT CCA CCA GTC TGA AAG GCA T-3′。(2)反應(yīng)體系：TBGreenPremix Ex Taq Ⅱ(10 μL)，上游和下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×，0.4 μL)，cDNA模板(2 μL)，dH2O(6 μL)。(3)擴(kuò)增：50 ℃、2 min；95 ℃、1 min；95 ℃、15 s；59 ℃、30 s；74 ℃、30 s；72 ℃、2 min，共40個(gè)循環(huán)。記錄擴(kuò)增曲線、熔解曲線、循環(huán)閾值(Ct)，采用ΔΔCt=2-ΔΔCt法計(jì)算mTOR、4EBP1和p70S6K1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將收集好的胸腔積液標(biāo)本由-80 ℃冰箱取出復(fù)溶，混勻后用新的EP管分裝標(biāo)本，每管取100 μL并按順序編號(hào)，置于冰上備用。將400 μL細(xì)胞蛋白裂解液(含PMSF)加入分裝好的標(biāo)本中，在冰上放置25 min，期間需研磨。在12 000 r/min條件下，將標(biāo)本放入4 ℃低溫超速離心機(jī)中離心10 min，取上清液，用BCA法測(cè)定其蛋白濃度。將蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入GAPDH(1∶10 000)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)，4EBP1(1∶1 000)、p-4EBP1(1∶1 000)、p70S6K1(1∶1 000)、p-p70S6K1(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，室溫?fù)u床上用TBST洗3次，稀釋HRP(1∶5 000)37 ℃室溫孵育2 h，用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。Image J軟件進(jìn)行灰度值數(shù)據(jù)測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25,P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。PCR數(shù)據(jù)采用ΔΔCt=2-ΔΔCt均一化方法處理，Western blot蛋白條帶采用Image J 進(jìn)行灰度值數(shù)據(jù)測(cè)定。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1mTOR、4EBP1、p70S6K1 mRNA表達(dá)情況 RT-qPCR顯示，惡性測(cè)定組mTOR、4EBP1、p70S6K1的mRNA表達(dá)水平均高于良性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組胸腔積液內(nèi) mTOR、4EBP1、p70S6K1 mRNA表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.2mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達(dá)情況 Western blot顯示，兩組胸腔積液內(nèi)mTOR、4EBP1、p70S6K1蛋白表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 ) 。惡性測(cè)定組p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表達(dá)水平高于良性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)兩組胸腔積液內(nèi)各蛋白的表達(dá)

表2 兩組胸腔積液內(nèi)mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

在惡性腫瘤中，最常見(jiàn)的引起胸膜轉(zhuǎn)移癌的是肺癌，其次是乳腺癌、惡性淋巴瘤，胃癌、結(jié)直腸癌等較少見(jiàn)[5]。MPE通常是胸膜轉(zhuǎn)移癌患者的首發(fā)癥狀，也是晚期腫瘤患者的預(yù)后影響因素。MPE的存在通常意味著患者疾病進(jìn)入晚期[6]，中位生存期一般為3～12個(gè)月[7]，腫瘤伴MPE的患者病死率高于無(wú)MPE的患者[8]。盡早確定胸腔積液的性質(zhì)對(duì)下一步治療有很重要的參考價(jià)值。目前臨床上常用的診斷MPE的有效方法仍是脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。由于胸腔積液的脫落細(xì)胞存在非典型性的形態(tài)，增生的間皮細(xì)胞與分化良好的腺癌細(xì)胞在形態(tài)上難以鑒別，從而造成結(jié)果的誤判，使得液基薄層細(xì)胞檢測(cè)(TCT)的特異度高，但靈敏度低。由于TCT診斷性能評(píng)價(jià)仍存在不足，探尋彌補(bǔ)其不足之處的新胸腔積液診斷靶標(biāo)勢(shì)在必行。

mTOR-4EBP1/p70S6K1信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及蛋白質(zhì)的合成過(guò)程中占據(jù)重要地位。mTOR是一種重要的進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其作為多條信號(hào)通路匯聚的交點(diǎn)，可整合各通路傳遞的信息并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活及自噬等過(guò)程作出相應(yīng)調(diào)節(jié)。在腫瘤患者中mTOR信號(hào)在多種因子的刺激下過(guò)度激活為p-mTOR；在p-mTOR的作用下，下游的兩個(gè)重要因子4EBP1和p70S6K1磷酸化(p-4EBP1、p-p70S6K1)[9-10]，p-4EBP1失去與真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E(eIF4E)結(jié)合的能力，eIF4E與亞單位eIF4G、eIF4A和eIF4B結(jié)合形成eIF4F復(fù)合物，加速Cap-依賴型的mRNA的翻譯過(guò)程；p-p70S6K1可磷酸化S6核糖體蛋白，從而使5′TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯過(guò)程加快；兩者發(fā)揮作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成與增殖。本研究通過(guò)對(duì)mTOR-4EBP1/p70S6K1信號(hào)通路在良惡性胸腔積液中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，從分子水平上探明此信號(hào)通路在BPE及MPE中均有表達(dá)，且根據(jù)其基因和蛋白水平表達(dá)的趨勢(shì)變化可以初步推測(cè)是通過(guò)激活了mTOR進(jìn)而使4EBP1、p70S6K1磷酸化，來(lái)調(diào)節(jié)胸腔積液中惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。

本研究顯示，惡性測(cè)定組的mTOR、4EBP1及p70S6K1 mRNA的表達(dá)水平高于良性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與此信號(hào)通路對(duì)原發(fā)腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)相一致[11]。同時(shí)，本研究顯示，惡性測(cè)定組p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表達(dá)水平明顯高于良性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；mTOR、4EBP1、p70S6K1在惡性測(cè)定組中的表達(dá)水平稍高于良性對(duì)照組，變化趨勢(shì)與磷酸化后一致，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？赡茉?yàn)镸PE中，p-mTOR具有活性，從而刺激4EBP1上的Thr37/46、Thr70、Ser65位點(diǎn)，使得4EBP1變成磷酸化形式(p-4EBP1)，p-4EBP1失去與eIF4E結(jié)合的能力，eIF4E與亞單位eIF4G、eIF4A和eIF4B結(jié)合形成eIF4F復(fù)合物，加速Cap-依賴型的mRNA的翻譯過(guò)程[12]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成與增殖。p-mTOR的過(guò)度活化刺激p70S6K1上的Thr389位點(diǎn)，使其成為磷酸化形式(p-p70S6K1)，從而具備生物學(xué)活性發(fā)揮作用，p-p70S6K1可磷酸化S6核糖體蛋白，從而使5′TOP結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯過(guò)程加快[13]。mTOR、4EBP1及p70S6K1信號(hào)分子在基因?qū)用婧偷鞍讓用娴谋磉_(dá)變化相一致，也與該信號(hào)通路在其他腫瘤細(xì)胞中變化相一致[14]。

綜上所述，mTOR-4EBP1/p70S6K1信號(hào)通路在BPE和MPE中表達(dá)存在差異，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝及其轉(zhuǎn)移中該信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用，可作為新的分子靶標(biāo)，對(duì)臨床鑒別診斷胸腔積液的性質(zhì)具有提示性作用。對(duì)于此信號(hào)通路在胸腔積液中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。