尤夢瑤，萬 璐，閆佳佳，張 赫，鄭春英

（1黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

甘草為烏拉爾甘草(G.uralensis)、光果甘草(G.glabra)或脹果甘草(G.inflata)的干燥根和根莖[1]，具有抗菌[2]、抗氧化[3]、抗病毒[4]、抗炎[5]、抗糖尿病[6]等作用。目前，已從甘草中分離得到300多種黃酮類化合物[7]和50多種三萜類成分[8]及多糖[9]等成分，其中三萜類主要活性成分甘草次酸表現(xiàn)出了強大抗SARS病毒及HIV-1病毒的作用[10]，同時，其黃酮類主要活性成分甘草苷在新冠病毒(COVID-19)流行的大環(huán)境下也表現(xiàn)出了強大抗病毒能力，通過防止病毒進入受體細胞以及破壞病毒受體與靶細胞的結合來達到免受病毒危害的作用[11]。甘草及其主要活性成分現(xiàn)廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè)[12]。世界甘草年消費量為1000萬t，其中90%來自中國，中國是甘草的主要生產(chǎn)區(qū)[13]。

寒地黑土造就了北方烏拉爾甘草的特有品質(zhì)，是寒地龍藥的領軍品種。Wayne C.Liao等[14]在研究烏拉爾甘草與光果甘草品質(zhì)時，采用HPLC和LC/MS方法同時檢測烏拉爾甘草和光果甘草中15種活性成分，結果發(fā)現(xiàn)，烏拉爾甘草含有槲皮素成分；而光果甘草不含此成分；同時，自由基清除實驗結果表明，烏拉爾甘草的作用優(yōu)于光果甘草。

由于大量需求，野生烏拉爾甘草因過度采挖而瀕臨滅絕[15]，現(xiàn)已被列入《野生藥材資源保護條例》的國家二級保護植物[16]，栽培種植雖然是解決甘草緊缺的替代方法[17]，但其采收期為2～3年，種植企業(yè)及農(nóng)戶資金回籠較慢，因此，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘草活性成分是一個關鍵的課題。

1 植物內(nèi)生菌

植物內(nèi)生菌“Endophytes”是由DeBary在1866年首次提出的[18]，植物內(nèi)生菌指生活在植物組織的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的微生物。1993年，Stierle.A等[19]采用微生物發(fā)酵法首次從短葉紅豆杉韌皮部的內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)中分離到了紫杉醇。自此，越來越多的學者開始對植物內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物展開了研究。

內(nèi)生菌與宿主植物互利共生，內(nèi)生菌可通過合成生物活性物質(zhì)或刺激宿主植物合成次生代謝產(chǎn)物來抵御病原菌及外來物質(zhì)的侵害，從而為宿主植物提供內(nèi)生菌生存所必須的生活環(huán)境。內(nèi)生菌在與宿主植物協(xié)同進化過程中，可以合成大量的活性代謝物[20]，如生物堿[21]、酚類[22]、醌類[23]、黃酮[24]等，還可以合成一些結構新穎的活性代謝物，因而具有重要的開發(fā)應用價值[25]。

植物內(nèi)生菌的特點是種類多、數(shù)量大，因其種類的不同，研究人員把其大致劃分為三大類，即：內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[26]。植物內(nèi)生菌在陸生和水生植物中普遍存在，在植物的不同器官，甚至組織細胞以及細胞間隙中也存在。近年來，已從不同植物的不同植物器官中分離得到大量內(nèi)生菌[27]。

內(nèi)生真菌是植物中最豐富的內(nèi)生菌之一。常見的內(nèi)生真菌包括毛囊菌屬、枝孢子菌屬、毛霉、黑孢菌、青霉菌、多孔菌、木霉、毛藻等[28]。植物內(nèi)生真菌的多樣性還體現(xiàn)在其活性代謝物的多樣性，如：Zheng[29]等從西洋參根部分離出內(nèi)生真菌中檢測到了人參皂苷、青霉酸、麥角甾醇以及布雷菲德菌素等代謝產(chǎn)物；He等[30]對藤黃內(nèi)生真菌進行體外發(fā)酵培養(yǎng)，采用NMR、HPLC分析以及TLC檢視等分析該菌株發(fā)酵后的活性代謝產(chǎn)物，結果發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠產(chǎn)生α-環(huán)己酮酸(α-CPA)、曲酸等特異性成分；Marie[31]等采用HPLC以及TLC檢視，檢測三七根內(nèi)生真菌發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中既含有與宿主植物相同的吲哚-3-乙酸，也含有特異性成分黃柄曲霉素。

內(nèi)生細菌可以分為兼性內(nèi)生細菌和專性內(nèi)生細菌，專性內(nèi)生細菌存活條件相對苛刻，只能在植物體內(nèi)生存，而兼性內(nèi)生細菌不但可以存活在宿主植物體內(nèi)，也可以存活在宿主植物的根際和其所在的土壤之中[32]；內(nèi)生放線菌是指其生活史的部分或全部存在于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，對宿主植物不構成危害的放線菌[33]。

2 甘草內(nèi)生菌研究概況

2.1 甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定

國內(nèi)對甘草內(nèi)生菌的研究始于2007年，宋素琴等[34]首先從新疆脹果甘草不同組織段中分離得到149株內(nèi)生細菌和2株內(nèi)生真菌，此后對甘草內(nèi)生菌的研究就成為一個熱點。部分對甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定工作見表1。

表1 甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定

從表1可以看出，關于甘草內(nèi)生菌的分離多采用表面消毒的方法，從其不同產(chǎn)地、不同甘草部位中分離內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌，并進行初步的菌種鑒定。

國外暫未見關于甘草內(nèi)生菌及其活性代謝物研究的報道。

2.2 甘草內(nèi)生菌的多樣性

甘草內(nèi)生菌的多樣性體現(xiàn)在不同生態(tài)環(huán)境、不用產(chǎn)地下產(chǎn)內(nèi)生菌的情況不同。孫一帆等[40]在比較野生甘草和栽培甘草內(nèi)生菌的多樣性發(fā)現(xiàn)，從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗吉日嘎朗圖鎮(zhèn)野生甘草根中共分離得到的214株內(nèi)生真菌，共歸屬為9個屬，從北京中醫(yī)藥大學望京藥園栽培甘草根中分離得到151株內(nèi)生真菌，共歸屬為6個屬，通過與北京中醫(yī)藥大學望京藥園栽培甘草相比，結果發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗吉日嘎朗圖鎮(zhèn)野生甘草內(nèi)生真菌具有更高的豐富度和多樣性，這可能表明野生甘草為了適應更加惡劣的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)生真菌具有較多的豐富度和多樣性；陳靜等[41]分別從甘肅、寧夏、內(nèi)蒙、新疆、北京5個地區(qū)的129株烏拉爾甘草(G.uralensis)中共分離得到438株內(nèi)生真菌，其中鐮孢菌屬(Fusarium)和曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢菌屬。通過研究甘草內(nèi)生菌的多樣性可以為甘草內(nèi)生菌的資源利用和開發(fā)提供基礎，也為進一步研究內(nèi)生菌對甘草藥材的質(zhì)量影響提供理論依據(jù)。

2.3 甘草內(nèi)生菌藥理作用

2.3.1 抑菌作用 趙妮等[42]對甘肅野生與栽培的烏拉爾甘草菌進行分離，共分離得到20株內(nèi)生細菌，其中18株內(nèi)生細菌對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，3株內(nèi)生細菌對肺炎鏈球菌有抑菌活性，并且其抑菌活性強于甘草總黃酮、水煎液或甘草總皂苷中的抑菌活性；朗多勇等[37]對寧夏鹽池甘草(G.uralensis)進行分離共得到140株內(nèi)生細菌，發(fā)現(xiàn)其中42株內(nèi)生細菌對金黃色葡萄菌有抑菌作用，5株內(nèi)生細菌對西瓜枯萎病菌有抑菌作用，10株內(nèi)生細菌對煙草赤星病菌有抑菌作用，9株內(nèi)生細菌對小麥枯萎病菌有抑菌作用，3株內(nèi)生細菌對棉花枯萎病菌有抑菌作用，2株內(nèi)生細菌對黃花枯萎病菌有抑菌作用；劉霞等[43]在探究甘草內(nèi)生真菌對灰霉病菌的抑制活性時，發(fā)現(xiàn)其中1株內(nèi)生菌株的發(fā)酵上清液可破壞灰霉病菌菌絲細胞的形態(tài)和結構，此外，該菌種在活體黃瓜幼苗中有一定的傳導性。

2.3.2 降血糖 楊明俊等[44]對所分離得到的36株甘草內(nèi)生真菌進行降血糖活力的測定，發(fā)現(xiàn)其中有6株內(nèi)生真菌具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，表現(xiàn)出較好的降血糖能力。

2.3.3 止咳化痰作用 曼瓊等[45]對從野生與栽培的烏拉爾甘草中分離、純化得到的12株具有抑菌和抗炎作用的甘草內(nèi)生細菌進行研究，發(fā)現(xiàn)其中有5株甘草內(nèi)生菌對化痰作用有一定的改善作用；楊志軍等[46]采用氨水引咳、SO2引咳來探究甘草內(nèi)生菌與水煎液的止咳作用，發(fā)現(xiàn)2株甘草內(nèi)生細菌具有止咳作用，1株甘草內(nèi)生細菌具有祛痰作用。

2.3.4 抗腫瘤作用 王麗等[47]對甘草內(nèi)生真菌dG9-1菌株發(fā)酵液進行3個濃度梯度的處理后進行腫瘤抑制實驗，發(fā)現(xiàn)其高濃度的發(fā)酵液對宮頸腫瘤細胞Hela-60抑制率為35.9%，具有良好的抑制腫瘤作用。

2.4 甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物研究

根據(jù)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物與宿主植物具有相關性的理論，已有報道從甘草內(nèi)生菌中分離出與甘草成分相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，為進一步開發(fā)利用甘草內(nèi)生菌奠定基礎，甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物提取分離情況見表2。

表2 甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物提取分離

由表2可知，在甘草內(nèi)生菌中含有甘草次酸、甘草苷、甘草素等與宿主植物相同的次生代謝產(chǎn)物，可以采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)上述原料，同時，在上述的研究工作中大多采用有機溶劑提取和柱色譜分離的方法，由于次生代謝產(chǎn)物在內(nèi)生菌發(fā)酵液中的含量較低，導致分離通常存在一定的盲目性。因此為了系統(tǒng)研究甘草內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物，應在其提取分離前先對甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液進行系統(tǒng)分析，并根據(jù)分析結果進行有目的的系統(tǒng)分離。

3 展望

內(nèi)生菌作為一種新型微生物資源，其研究工作一直以來都是國際研究的一個熱點，但目前仍處于基礎研究階段[54]。近年來圍繞甘草內(nèi)生菌的相關研究逐步增多，這主要源于其主要活性成分甘草次酸及甘草苷的活性作用及其需求，但縱觀甘草內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究工作大多集中于內(nèi)生菌分離鑒定，且雖然篩選得到能夠產(chǎn)生與宿主植物相同次生代謝產(chǎn)物的目的菌株，但其產(chǎn)量低、次生代謝產(chǎn)物的提取分離工作尚未形成體系。

為了定向得到高產(chǎn)量的次生代謝產(chǎn)物，可以分析其生物合成途徑，通過檢測生物合成途徑的前體化合物的存在，推測發(fā)酵后可能含有一些次生代謝產(chǎn)物，從而可以調(diào)控這個生物合成的途徑，定向的生產(chǎn)目標產(chǎn)物。

同樣，若想高效生產(chǎn)甘草苷也可以通過定向調(diào)控其生物合成途徑、分析其前體化合物來實現(xiàn)。甘草苷生物合成途徑見圖1[55]。

圖1 甘草苷生物合成途徑

通過圖1可發(fā)現(xiàn)查爾酮異構酶(CHI)是甘草苷的生物合成途徑中的關鍵酶及限速酶。它能夠催化分子內(nèi)的環(huán)化反應，使雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為具有生物學活性的三環(huán)(2S)-黃烷酮，再進一步反應生成甘草苷。

此外，在甘草苷生物合成途徑中，若在內(nèi)生菌的發(fā)酵液中檢測前體化合物反式肉桂酸等化合物的存在，可以推測在發(fā)酵的過程中可能含有異甘草素、查爾酮、甘草苷等一系列活性成分出現(xiàn)，從而可以調(diào)控這個生物合成的途徑，定向的生產(chǎn)目標產(chǎn)物甘草苷。

同理，甘草次酸合成途徑屬于三萜化合物合成途徑。首先，2,3氧化鯊烯為底物在β香樹脂醇合酶催化下生成β-香樹脂醇，之后由CPR催化β-香樹脂醇碳11位首先羥基化，然后進一步氧化為11-氧-β-香樹脂醇，在此基礎上，由CPR繼續(xù)催11-氧-β-香樹脂醇碳30位羥基化，之后進一步氧化生成醛，最后氧化生成羧基形成甘草次酸，其具體合成途徑見圖2[55]。

通過圖2可發(fā)現(xiàn)在次甘草酸生物合成途徑中，若能在次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生菌的發(fā)酵液中檢測前體化合物的存在，可以推測在發(fā)酵的過程中含有甘草次酸等一系列活性成分出現(xiàn)，從而可以調(diào)控這個生物合成的途徑，定向的生產(chǎn)目標產(chǎn)物甘草苷。

圖2 甘草次酸生物合成途徑

近年來，黃酮類、多糖類、皂苷類等活性成分可采用內(nèi)生菌發(fā)酵法生產(chǎn)，從而解決由于資源稀缺、藥用植物的市場受到限制等所引發(fā)的原料緊缺問題。因此，從甘草中分離內(nèi)生菌，篩選具有活性的內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物，對于解決中國甘草野生資源匱乏、提供新型甘草活性成分生產(chǎn)方法具有重要的意義。