滑繼愛衛(wèi)雪曼張 娜陳鵬舉馬 翔＊,,4

(1太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，太原030008)

(2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科，上海200081)

(3太原工業(yè)學(xué)院生化藥學(xué)實驗室，太原030008)

(4南京大學(xué)配位化學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，南京210023)

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)作為蛋白錯誤折疊類疾病中最為典型的代表[1]，近年來逐漸成為生物無機(jī)化學(xué)與藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[2]。由淀粉樣蛋白(Aβ)錯誤折疊聚集而形成的老年斑是AD主要的病理特征[3-4]。處于非β折疊構(gòu)象狀態(tài)的Aβ是大腦內(nèi)一種正常代謝的膜蛋白，能夠參與特定的生理活動[5-6]。然而，當(dāng)處于病理狀態(tài)時，例如腦內(nèi)存在錯誤折疊的Aβ模板或者金屬離子處于紊亂狀態(tài)，Aβ可以轉(zhuǎn)化成為具有極強(qiáng)神經(jīng)毒性的富含β錯誤折疊的聚集體[7-10]。此外，新生的金屬-Aβ蛋白復(fù)合物能夠催化產(chǎn)生大量的活性氧物種(ROS)，而ROS也被認(rèn)為是造成神經(jīng)元損傷的重要誘導(dǎo)物質(zhì)[2,10-11]。因此，抑制Aβ的錯誤折疊聚集過程以及消除ROS被認(rèn)為是治療AD的關(guān)鍵。

據(jù)報道，Aβ錯誤折疊聚集體的形成途徑是可以被調(diào)節(jié)的[12]，其中小分子化合物(如dopamine、calmidazolium chloride以及鉑類配合物等)可以抑制Aβ的纖維化[13-16]。近來，多金屬氧酸鹽(POMs)被發(fā)現(xiàn)可以用來抑制蛋白的錯誤折疊。曲曉剛教授課題組報道了一系列基于Dawson結(jié)構(gòu)的Aβ聚集抑制劑[17-19]。劉杰教授也利用納米級的鉬簇成功干預(yù)了Aβ的聚集過程[20]。我們設(shè)計了一種有機(jī)無機(jī)雜化的基于Keggin結(jié)構(gòu)的POM，其可以通過氫鍵等非共價作用力調(diào)控Aβ聚集體的β錯誤折疊構(gòu)象，進(jìn)而使聚集體瓦解[21]。然而，迄今為止，上述設(shè)計的POMs都是單功能調(diào)節(jié)劑，沒有直接的抗氧化作用。藥物化學(xué)最新觀點(diǎn)認(rèn)為，之所以用單靶點(diǎn)藥物治療AD這種多病因疾病難以取得理想的療效，是因為疾病的多因子特點(diǎn)和細(xì)胞補(bǔ)償機(jī)制使單靶點(diǎn)作用不足以促成發(fā)病系統(tǒng)的復(fù)原[22]。因此，復(fù)合Aβ構(gòu)象調(diào)節(jié)能力和抗氧化功能的分子可能會更有效地應(yīng)對這些棘手的問題。

在本文中，我們將介紹一例新設(shè)計、合成的一維線狀納米尺度的鈷取代磷鉬酸鹽化合物(H2en)6{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}3·11H2O(簡 稱CoPM,en=乙 二胺)。據(jù)我們所知，CoPM是第一例純無機(jī)的一維鏈狀鈷取代的Strandberg結(jié)構(gòu)POM，其內(nèi)部還存在有趣的循環(huán)鏈節(jié)。CoPM能夠破壞Aβ聚集體的β折疊構(gòu)象，并且還能夠消除其產(chǎn)生的ROS。作為概念的驗證，多功能分子CoPM為治療AD提供了一種新的思路和方法，具有較大的潛在應(yīng)用價值和理論研究意義。

1 實驗部分

1.1 試劑

所用的試劑均為分析純試劑，購買后直接使用。氯化鈉(NaCl)、鹽酸(HCl)、醋酸鋅(Zn(OAc)2)、氯化銅(CuCl2)、氯化鈷(CoCl2)、十二水合磷酸氫鈉(Na2HPO4·12H2O)、en(C2H8N2)、二 水 合 鉬 酸 鈉(NaMoO4·2H2O)、人Aβ40購自麥克林化學(xué)試劑公司(中國)。硫黃素T(ThT)、2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、神經(jīng)生長因子7S(NGF-7S)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Sigma-Aldrich試劑公司(美國)。Aβ40、Zn(OAc)2和CuCl2的儲備溶液按照文獻(xiàn)報道的程序進(jìn)行配制[16]。所有溶液均通過Milli-Q超純水制備系統(tǒng)所制備的超純水配制，并通過0.22 μm過濾器(微孔隙)過濾。神經(jīng)元嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12細(xì)胞)來源于American Type Culture Collection(ATCC)。

1.2 合成

首先，分別制備了2種溶液A和B。溶液A：NaMoO4·2H2O(2.416 g，10.00 mmol)和Na2HPO4·12H2O(2.399 g，6.70 mmol)在攪拌下溶解在水(30 mL)中。溶 液B：CoCl2(1.300 g，10.00 mmol)和en(0.10 mL，1.49 mmol)在攪拌下溶解在水(30 mL)中。攪拌10 min后，將得到的溶液B加入到溶液A中，于室溫下再攪拌10 min，然后使用HCl(6 mol·L-1)調(diào)節(jié)pH=5.0。所得混合液在95℃下回流1 h，而后熱過濾。所得濾液置于室溫下敞口揮發(fā)。1周后，有無色透明晶體從溶液中析出，表征其結(jié)構(gòu)為Strandberg結(jié)構(gòu)化合物H6P2Mo5O23[23]。然后使用塑料薄膜密封燒杯，以防止溶液進(jìn)一步揮發(fā)。大約3周后，無色透明晶體轉(zhuǎn)化為粉紅色晶體，晶體照片見圖S1插圖(Supporting information)，產(chǎn)率基于Na2MoO4·2H2O計算，約為25%。元素分析(C12H106Co3Mo15N12O92P6)理論值(%)：C 3.90，N 4.55，H 2.89；測試值(%)：C 3.85，N 4.48，H 2.77。

1.3 實驗方法

1.3.1 X射線衍射數(shù)據(jù)的收集與結(jié)構(gòu)精修

衍射數(shù)據(jù)于296 K下，在Bruker Apex-2衍射儀CCD探測器上收集，使用MoKα射線(λ=0.071 073 nm)。使用SAINT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算[24]。采用了常規(guī)的洛倫茲修正和偏振校正。使用SADABS法進(jìn)行多掃描吸收校正[25]。該結(jié)構(gòu)采用直接方法求解，并在F2上使用全矩陣最小二乘進(jìn)行細(xì)化。剩下的原子是在F2上連續(xù)的全矩陣最小二乘細(xì)化得到的并經(jīng)傅里葉合成。所有計算均使用SHELXL-97程序包運(yùn)行[26]。CoPM的單晶和結(jié)構(gòu)精修數(shù)據(jù)在表1中展示。

表1 CoPM的單晶和結(jié)構(gòu)精修數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic and structural refinements data for CoPM

CCDC：1944799。

1.3.2 常規(guī)表征

紅外光譜使用KBr壓片在NICOLET iS10紅外光譜儀上4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。元素分析由PQEXCeⅡICP-MS進(jìn)行。熱重分析(TGA)在STA449F3 TG-DSC分析儀上進(jìn)行。將含有或不含CoPM(200 μmol·L-1)的Aβ40(200 μmol·L-1)、D2O/H2O/DMSO-d6混合液(10∶85∶5，V/V)于37℃孵育24 h，離心得到上清液。上清液的1H NMR譜由Bruker DRX-600核磁共振譜儀測試。

1.3.3 生化實驗

ThT熒光法：將Aβ40(20 μmol·L-1)溶解在Tris緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl+150 mmol·L-1NaCl，990 μL)中并與Zn(OAc)2(4 μL，10 mmol·L-1)混合。然后分別加入CoPM(最終濃度為0～25 μmol·L-1)，并在37℃水溶液中孵育24 h。每個樣品(300 μL)被分別注入到96孔黑色板(康寧Costar公司)的一個孔中。每個孔同時加入ThT溶液(2 μL，5 mmol·L-1)，并在37℃再孵育1 h。熒光強(qiáng)度(λex=415 nm，λem=485 nm)由Varioskan Flash microplate reader(Thermo Scientific)記錄。數(shù)據(jù)由至少3個獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

比濁度法：樣品的制備方法如上所述。每個樣品都被注入一個96孔透明板(康寧Costar公司)的孔中。記錄位于405 nm處的吸光度來反映溶液的濁度。數(shù)據(jù)以3個獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

形態(tài)學(xué)分析：樣品的制備方法與ThT熒光法相同。在室溫下，在300目的碳涂層銅網(wǎng)上滴加1滴樣品溶液(10 μL)。2 min后，除去多余的溶液，并使用醋酸鈾酰(10 μL，0.01 g·mL-1)染色，然后用二次水(10 μL)洗滌。樣品在JEOL JEM-2100 LaB6(HR)透射電子顯微鏡(TEM)上進(jìn)行觀測(100 kV)。

圓二色譜(CD)法：將Aβ40(20 μmol·L-1)溶解在Tris緩沖液中，并分別加入Zn(OAc)2或者CuCl2(40 μmol·L-1)。然后將CoPM(20 μmol·L-1)加入上述溶液中，在37℃下孵育24 h。樣品溶液的CD光譜在

JASCO J-810 automatic recording spectropolarimeter(日本東京)上測量，測量范圍為190～260 nm。以Tris緩沖溶液的結(jié)果為陰性對照。

ROS抑制實驗：DCFH-DA儲備液(1 mmol·L-1)和辣根過氧化物酶(HRP，4 μmol·L-1)用Tris緩沖液按照文獻(xiàn)方法制備[27]。將含有Aβ40(20 μmol·L-1)的溶液 與CuCl2(40 μmol·L-1)混 合，并 加 入CoPM(20 μmol·L-1)。然后，在樣品中加入抗壞血酸溶液(10 μmol·L-1)，并于37℃下孵育10 min。將以上樣品(200 μL)注入到96孔黑色板的一個孔中。然后將HRP(0.04 μmol·L-1)和DCFH-DA(100 μmol·L-1)注入孔中，并在37℃下避光孵育。熒光強(qiáng)度(λex=485 nm，λex=650 nm)由Varioskan Flash microplate reader(Thermo Scientific)從0到2 400 min每隔10 min測量1次。其他實驗對照組均按上述方法進(jìn)行分析。

MTT法：用于測試神經(jīng)毒性和突觸功能障礙的PC12細(xì)胞如文獻(xiàn)方法進(jìn)行培養(yǎng)[28]。分化成熟的PC12細(xì)胞與Aβ40(20 μmol·L-1)以及CoPM(20 μmol·L-1)共孵育24 h，而后采用MTT法評價CoPM對Aβ聚集體神經(jīng)毒性的抑制性效果。其他對比組均按上述方法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以至少3個獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析：用于此形態(tài)學(xué)分析的PC12細(xì)胞如上所述制備。培養(yǎng)24 h后，用熒光倒置顯微鏡捕捉這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)照片。

統(tǒng)計分析方法：結(jié)果來自3個獨(dú)立的實驗，并以獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。結(jié)果采用雙倍方差分析(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 晶體結(jié)構(gòu)

通過X射線單晶衍射對CoPM的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析，其鍵長數(shù)據(jù)見表S1。如圖1a所示，X射線單晶衍射結(jié)構(gòu)分析顯示，CoPM是由Strandberg結(jié)構(gòu)的磷鉬氧簇[P2Mo5O23]6-和鈷配合物[Co(H2O)4]2+交替連接而形成。有趣的是，CoPM并不是一個簡單的一維鏈化合物，事實上，如圖1b和1c所示，CoPM鏈的每個循環(huán)單元包含3個{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}4-最小結(jié)構(gòu)單位，這些結(jié)構(gòu)單位各自的延展方向與配位環(huán)境均不相同(見鍵價和(BVS)計算部分)，這在POM化學(xué)中是非常少見的。如圖1d所示，[P2Mo5O23]6-簇可以被認(rèn)為是一個由5個接近共平面的{MoO6}八面體(Mo—O：0.169 0(9)～0.251 1(9)nm)通過共角/共邊而形成的扭曲的褶環(huán)，褶環(huán)中心上各配位了一個{PO4}四面體(P—O：0.149 3(9)～0.157 7(9)nm)。如圖1e所示，[Co(H2O)4]2+作為一個連接體通過與2個相鄰的[P2Mo5O23]6-極點(diǎn)位置上的P配位而形成一維無限延展結(jié)構(gòu)。據(jù)我們所知，CoPM是第一例純無機(jī)一維鈷取代Strandberg型多聚磷鉬酸鹽。CoPM的紅外譜圖及熱重分析圖見圖S1和S2。

圖1 (a)CoPM的一維鏈狀結(jié)構(gòu)多面體示意圖;(b)CoPM最小循環(huán)單元多面體結(jié)構(gòu)示意圖;(c)CoPM最小循環(huán)單元球棍結(jié)構(gòu)示意圖;(d)[P2Mo5O23]6-多面體結(jié)構(gòu)示意圖;(e)CoPM中鈷離子的配位環(huán)境示意圖Fig.1(a)Combined polyhedral/ball-and-stick view of the 1D linear structure of CoPM;(b)Polyhedral view of one CoPM subunit in the crystal;(c)Ball-and-stick representation of one CoPM subunit in the crystal;(d)Polyhedral view of one[P2Mo5O23]6-;(e)Polyhedral view of the coordination mode of Co ions in CoPM

根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，我們進(jìn)一步計算了CoPM中Co和P的氧化態(tài)(Vi)[29]。簡單地說，CoPM中陽離子i的氧化態(tài)計算公式如下：

其中sij表示陽離子i和陰離子j之間的鍵價，rij表示表S1中列出的實測鍵長，而r0′則表示2個離子間鍵長的理論值，B設(shè)定為0.37[29]。Mo—O鍵長的理論值來自于文獻(xiàn)，其中的r0′(Mo6+—O)和r0′(Mo5+—O)分別為0.191 5和0.184 8 nm，r0′(P5+—O)為0.162 4 nm,r0′(Co2+—O)為0.169 2 nm[29-30]。如表S2所示，CoPM中Co和P的Vi分別為2.019和4.955。此外，每個Strandberg結(jié)構(gòu)磷鉬氧簇由一個Mo5+和4個Mo6+構(gòu)成。

目前，基于POMs的不同結(jié)構(gòu)，其與Aβ相互作用的分子作用機(jī)制可概括為2種類型：第1類即通過POMs上的過渡金屬離子(例如鈷離子[18]、鎘離子[31])與Aβ上咪唑基團(tuán)直接發(fā)生配位作用，進(jìn)而影響Aβ的聚集。第2類即POMs通過其富氧表面[21]或靜電作用[20,32]干預(yù)構(gòu)成β折疊所必需的Aβ之間氫鍵的形成，進(jìn)而影響其聚集過程。CoPM的分子設(shè)計同時滿足上述2種作用模式所需的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

首先，CoPM的鏈節(jié)中含有大量鈷離子，這些鈷離子與構(gòu)筑塊上的2個氧原子及4個配位水形成較為穩(wěn)定的六配位八面體構(gòu)型。當(dāng)與咪唑基相遇時，根據(jù)軟硬酸堿理論可知，配位能力稍弱的水分子會被咪唑基團(tuán)取代，從而使得鈷離子與Aβ形成更穩(wěn)定的配合物[18]。因此，我們使用核磁共振譜研究了CoPM孵育后Aβ聚集體的咪唑基信號。如圖2a所示，位于δ=6.8、7.5和8.0處的幾組峰對應(yīng)于Aβ上咪唑殘基的3個氫的核磁信號[16]。然而，如圖2b所示，在與CoPM共孵育后，1H NMR信號發(fā)生了很大的變化，這表明Aβ上的咪唑基團(tuán)的化學(xué)環(huán)境受到了較大的影響，尤其是3號位的氫幾乎消失，說明CoPM與Aβ間存在配位作用。

圖2 Aβ40(a)及其與CoPM在37℃和pH 7.4條件下共孵育(b)24 h后的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectra of Aβ40 in the absence(a)and presence(b)of CoPM after incubation at 37℃and pH 7.4 for 24 h

其次，作為純無機(jī)POMs，CoPM的構(gòu)筑塊具有很高的負(fù)電荷和豐富的表面氧原子[33]。CoPM中的70個氧原子可分為端氧Ot、二重橋氧Oμ2、三重橋氧Oμ3和四重橋氧Oμ4。如圖3所示，BVS為0～1.60之間的O原子可以作為質(zhì)子供體；而BVS為1.90～2.00之間的O原子具有比較密集的電子云，可以作為質(zhì)子的受體。因此，CoPM表面的O原子可以與其他質(zhì)子供體或者受體(例如蛋白等)相互作用形成氫鍵。一般來說，POMs構(gòu)筑塊上會有離域的質(zhì)子附著，這種現(xiàn)象在POM化學(xué)中很常見，在許多文獻(xiàn)中均有報道，例如[H3W12O40]5-[33]和[Ni(enMe)2]3[H6Ni20P4W34(OH)4O136(enMe)8(H2O)6]·12H2O[34]。

圖3 CoPM最小重復(fù)單元中O的BVSFig.3 BVS of O atoms in the CoPM unit

此外，CoPM的BVS計算也表明，其最小重復(fù)單元內(nèi)的3個基本單元所處的配位環(huán)境均不相同，有著不同的BVS。

2.2 Aβ錯誤折疊的抑制作用

由于Zn2+可以有效地誘導(dǎo)Aβ錯誤折疊聚集過程，因此，我們通過比濁度法和ThT熒光法研究CoPM對Zn2+誘導(dǎo)的Aβ的β折疊形成的抑制作用。濁度可反映溶液中所有類型蛋白聚集體的整體水平；ThT熒光法被廣泛用于檢測這些聚集體中的β折疊體的含量[35]。首先，Aβ與Zn2+共孵育而獲得富含各種聚集體的懸濁液。然后，在這些懸濁液中加入不同濃度的CoPM，孵育1 d，以測試其對已形成的β折疊構(gòu)象的影響。如圖4所示，隨著CoPM濃度的增加，ThT熒光急劇下降，這表明Aβ的錯誤折疊聚集過程被逆轉(zhuǎn)了。另一方面，這些溶液的濁度也在某種程度上隨著CoPM的加入而降低。考慮到CoPM對β折疊聚集體的綜合影響，我們選擇20 μmol·L-1進(jìn)行后面的實驗。

圖4 一系列濃度梯度的CoPM對Zn2+誘導(dǎo)的Aβ40錯誤折疊聚集體的干預(yù)效果：比濁法(左,柱狀圖)和ThT熒光法(右,線狀圖,λex=415 nm,λem=480 nm)Fig.4 Intervention effect of a series of concentration gradients of CoPM on Zn2+-induced Aβ40 misfolded aggregates：turbidimetry(left,histogram)and ThT assay(right,line graph,λex=415 nm,λem=480 nm)

2.3 形態(tài)學(xué)分析

接下來，我們使用TEM觀察CoPM對Zn2+、Cu2+以及自聚集誘導(dǎo)的Aβ錯誤折疊聚集體微觀形態(tài)的影響。如圖5a～5c所示，在各種誘導(dǎo)因素存在的情況下，與對照組相對照，這些溶液中均出現(xiàn)了纖維絲狀的蛋白聚集體，這是富含β錯誤折疊蛋白構(gòu)象的典型特征[35]。這些結(jié)果可以印證，在上述條件下，孵育液中存在著大量的富含β折疊構(gòu)象的Aβ聚集體。然而，如圖5d～5f所示，在CoPM存在下，沒有纖維絲狀物質(zhì)出現(xiàn)，取而代之的是一些類似油狀印記的無定形態(tài)物質(zhì)。

圖5 CoPM對各種因素誘導(dǎo)形成的Aβ40(20 μmol·L-1)聚集體影響的TEM圖Fig.5 TEM images for the effect of CoPM on Aβ40(20 μmol·L-1)aggregates induced by various factors

2.4 Aβ構(gòu)象調(diào)節(jié)

進(jìn)一步，我們利用CD譜驗證CoPM對Zn2+、Cu2+以及自聚集誘導(dǎo)的Aβ錯誤折疊體構(gòu)象的影響。如圖6所示，Aβ40與Cu2+共孵育后，在約215 nm處檢測到一個負(fù)峰，表明Cu2+誘導(dǎo)形成了β折疊構(gòu)象[32]。用Zn2+孵育后的Aβ?lián)碛幸粋€較Aβ40+Cu2+組更強(qiáng)的CD譜峰。這表明，Zn2+誘導(dǎo)效應(yīng)更加強(qiáng)烈。而在CoPM存在下，無論是Zn2+還是Cu2+孵育組，這個CD譜峰都出現(xiàn)了明顯的衰退。這說明CoPM可以抑制金屬離子誘導(dǎo)的Aβ的β折疊相關(guān)構(gòu)象轉(zhuǎn)化。此外，CoPM處理的Aβ40組的負(fù)CD譜峰也比單獨(dú)的Aβ40弱，這可能意味著CoPM也可以抑制Aβ的自聚集。目前，大多數(shù)報道的單功能螯合劑只能防止金屬離子誘導(dǎo)的構(gòu)象錯誤折疊，而不能與Aβ本身相互作用，因此對Aβ的自聚集束手無策[36]。以上結(jié)果表明，CoPM是通過調(diào)節(jié)β折疊構(gòu)象而非螯合機(jī)制起作用的。

圖6 CoPM對各種因素誘導(dǎo)形成的Aβ40聚集體構(gòu)象影響的CD譜圖Fig.6 CD spectra for the effect of CoPM on the conformation of Aβ40 aggregates induced by various factors

2.5 抑制ROS的產(chǎn)生

ROS是導(dǎo)致AD的另一個關(guān)鍵神經(jīng)毒性物種[2]。Cu2+-Aβ復(fù)合物能夠有效地催化ROS的產(chǎn)生，并對神經(jīng)元造成損傷[37]。因此，我們使用2′，7′-二氯熒光素(DCF)熒光法檢測CoPM對Cu2+介導(dǎo)的ROS生成的抑制作用。DCFH-DA本身沒有熒光，它可以在HRP存在下與ROS反應(yīng)，生成具有熒光的物質(zhì)DCF。因此，體系中DCF熒光的強(qiáng)弱可以揭示Cu2+-Aβ復(fù)合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS的總量[38]。如圖7所示，從始至終，CoPM與Cu2+-Aβ復(fù)合物共孵育組的DCF熒光強(qiáng)度明顯低于Cu2+-Aβ復(fù)合物對照組，這表明含有CoPM組的ROS總產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于無CoPM組的ROS產(chǎn)出量。此結(jié)果說明CoPM可以有效地抑制體系中ROS的生成[39]。

圖7 ZnPM、Cu2++Aβ、Cu2++Aβ+CoPM、CM、CoPM與純水孵育組和對照組的DCF熒光強(qiáng)度隨時間的變化曲線Fig.7 Variation curves of DCF fluorescence intensity with time for ZnPM,Cu2++Aβ,Cu2++Aβ+CoPM,CM,CoPM,and pure water incubation group and control group

以往文獻(xiàn)中報道，某些構(gòu)象調(diào)節(jié)劑也可以通過瓦解Cu2+-Aβ復(fù)合物而減少其ROS的產(chǎn)生，但其本身并無抗氧化作用[32]。因此，CoPM是通過瓦解能產(chǎn)生ROS的聚集體而抑制體系產(chǎn)生ROS，還是本身具備抗氧化性？這需要驗證。如圖7中插圖所示，單獨(dú)使用CoPM的實驗組產(chǎn)生的ROS明顯減少，甚至低于環(huán)境對照組。然而，同構(gòu)型的鋅取代的多金屬氧酸鹽(H2en)6{[Zn(H2O)4](P2Mo5O23)}3(ZnPM)則能夠產(chǎn)生大量的ROS[40]。以上實驗結(jié)果揭示，CoPM的結(jié)構(gòu)并不影響實驗組HRP的活性，并且CoPM本身即具有抗氧化功能。有趣的是，鉬酸鈷(CM)也在一定程度上具有抗氧化能力。而CoPM的抗氧化作用優(yōu)于CM，這說明CoPM獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有更強(qiáng)的抗氧化能力。綜上，與以往文獻(xiàn)報道的單功能螯合劑和調(diào)節(jié)劑相比，CoPM抑制ROS的機(jī)制是不同的[41]。一方面，CoPM可以像單功能螯合劑或者調(diào)節(jié)劑一樣通過解聚Cu2+-Aβ復(fù)合物來減少ROS的產(chǎn)生[41]；另一方面，CoPM自身就具有抗氧化特性，能夠?qū)h(huán)境中的ROS清除。據(jù)我們所知，CoPM是首例同時具有錯誤折疊構(gòu)象調(diào)節(jié)和抗氧化多功能的POM，這將拓展POM在抗蛋白錯誤折疊疾病中的應(yīng)用。

2.6 細(xì)胞毒性的抑制

我們以常用的PC12細(xì)胞為模型[42]通過MTT實驗研究CoPM對Aβ40和金屬離子誘導(dǎo)的Aβ40聚集體細(xì)胞毒性的抑制作用。如圖8所示，PC12細(xì)胞在Zn2+/Cu2+處理的Aβ40環(huán)境下孵育后，其存活率相當(dāng)?shù)?小于40%或30%)，這也與文獻(xiàn)報道一致，并提示這些Zn2+/Cu2+處理過的Aβ40聚集體對PC12細(xì)胞具有相當(dāng)高的毒性[43]。相比之下，在CoPM存在下，相應(yīng)的PC12細(xì)胞存活率達(dá)到約60%。此外，與單純Aβ40孵育組相比，有CoPM的Aβ40孵育組的細(xì)胞存活率將近70%。在以往的研究中，大多數(shù)單功能螯合劑只能通過競爭金屬離子而抑制它們對Aβ錯誤折疊的誘導(dǎo)作用，而螯合劑本身并不能與Aβ產(chǎn)生相互作用。因此，這些單功能螯合劑對Aβ自聚集體沒有影響，屬于間接作用機(jī)制[44-45]。而以上結(jié)果表明，CoPM不但可以抑制由金屬離子誘導(dǎo)而產(chǎn)生的Aβ錯誤折疊聚集體的神經(jīng)毒性；還能夠直接作用于Aβ自聚集本身，削弱它們的細(xì)胞毒性，這也是CoPM與以前的抗AD螯合劑之間的最為顯著的功能差異。

圖8 MTT法檢測CoPM對各種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的Aβ聚集體的細(xì)胞毒性抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of CoPM on the cytotoxicity of Aβ aggregates induced by various factors by MTT assay

接下來，我們通過觀察PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)一步研究CoPM對Aβ40自聚集和金屬離子誘導(dǎo)的Aβ40錯誤折疊聚集體的細(xì)胞毒性的抑制。如圖9所示，PC12細(xì)胞(對照組)呈多邊形，其中大多數(shù)細(xì)胞有厚而長的突觸，并與其他細(xì)胞連接而形成網(wǎng)絡(luò)。在與Zn2+/Cu2+誘導(dǎo)或自聚集的Aβ錯誤折疊聚集體孵育24 h后，PC12細(xì)胞呈現(xiàn)出球形，神經(jīng)突觸收縮，神經(jīng)元的樹突狀網(wǎng)絡(luò)被破壞(圖9a、9c和9e)。特別是與Aβ40+Cu2+孵育組，其神經(jīng)元上的突觸斷裂，細(xì)胞體開始膨脹并變成球形。與之相對，在CoPM存在的情況下，盡管仍有淀粉樣斑塊的沉積，但PC12的細(xì)胞形態(tài)盡可能保持完整(圖9b、9d和9f)，并且細(xì)胞體增大的趨勢也受到了抑制。細(xì)胞體多為梭形，突觸清晰可見。此外，神經(jīng)元的突觸網(wǎng)絡(luò)也被保留了下來。有研究報道，Aβ可以誘導(dǎo)產(chǎn)生突觸毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元突觸的損傷和功能障礙，因此對突觸的保護(hù)在抗AD中也是非常重要的內(nèi)容[46]。以上結(jié)果表明，CoPM可以保護(hù)神經(jīng)元，減輕Zn2+/Cu2+誘導(dǎo)或自聚集產(chǎn)生的Aβ錯誤折疊聚集體的毒害。

圖9 CoPM對各種因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的Aβ聚集體的細(xì)胞毒性抑制作用的細(xì)胞顯微照片F(xiàn)ig.9 Cell micrographs of the cytotoxic inhibitory effect of CoPM on Aβ aggregates induced by various factors

3 結(jié)論

淀粉樣蛋白(Aβ)的聚集在阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。β折疊構(gòu)象是這些具有細(xì)胞毒性物質(zhì)的核心結(jié)構(gòu)。此外，由這些有害聚集體所產(chǎn)生的活性氧物種(ROS)是另一個重要的神經(jīng)退行性因子。本文介紹了一例納米線狀鈷取代的多聚磷鉬酸鹽(H2en)6{[Co(H2O)4](P2Mo5O23)}3·11H2O(CoPM)，它復(fù)合了構(gòu)象調(diào)節(jié)和抗氧化雙功能。一方面，CoPM作為一種構(gòu)象調(diào)制劑，不但可以抑制由金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的富含β錯誤折疊的Aβ聚集體；還能夠抑制Aβ的自聚集；另一方面，CoPM作為一種抗氧化劑，能有效抑制和消除Cu2+-Aβ復(fù)合物所產(chǎn)生的ROS。因此，CoPM可以保護(hù)神經(jīng)元，減輕錯誤折疊的Aβ聚集體和ROS等相關(guān)神經(jīng)毒性物種的侵害。

還有許多疾病，如帕金森病、亨廷頓病、2型糖尿病、克-雅病和新變異型克-雅病，也是蛋白質(zhì)錯誤折疊類疾病[47-48]。其致病過程是相似的，即將蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)化為疏水的β錯誤折疊結(jié)構(gòu)，大量錯誤折疊的蛋白質(zhì)和由其產(chǎn)生的ROS破壞大腦細(xì)胞和組織。由于大多數(shù)該類疾病是多病因的，均涉及蛋白質(zhì)錯誤折疊和ROS氧化應(yīng)激[48]，因此，CoPM的復(fù)合多功能設(shè)計思路亦有可能應(yīng)用于抗其他蛋白錯誤折疊疾病藥物的開發(fā)[5,48]。Supporting information is available at http：//www.wjhxxb.cn