冷雨佳，段曉杰，陳復(fù)生

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

鋅是人體日常必需的微量元素之一，能促進(jìn)生長和組織再生、保護(hù)皮膚健康、增強(qiáng)人體免疫力，缺鋅會導(dǎo)致身體抵抗力下降、生長發(fā)育遲緩[1]。鋅缺乏現(xiàn)象在發(fā)展中國家仍普遍存在，一些特殊的人群需要額外的補(bǔ)充劑來維持健康[2]。由于無機(jī)鋅具有刺激胃腸道、吸收利用率低等缺點(diǎn)，因此尋找安全、吸收利用率高的富鋅產(chǎn)品逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)[3-4]。天然蛋白源肽鋅螯合物作為一種新興的鋅補(bǔ)充劑，因其營養(yǎng)豐富、安全性高、易吸收的特性而具有巨大的開發(fā)潛力。肽鋅螯合物是蛋白多肽與鋅離子配位形成的環(huán)狀絡(luò)合物，可從許多食物蛋白質(zhì)中制備，如芝麻蛋白[5]、乳清蛋白[6]、牡蠣蛋白[7]等。與無機(jī)鋅鹽相比，鋅與多肽反應(yīng)后形成可溶性鋅螯合物，更容易被胃腸道吸收[8]。大豆作為世界第二大植物油料，是人類和動物重要的植物性蛋白來源，具有高產(chǎn)量、低成本和良好氨基酸組成的特點(diǎn)[9]，經(jīng)過提煉大豆油后其副產(chǎn)物仍富含蛋白質(zhì)和纖維。大豆蛋白經(jīng)酶水解產(chǎn)成的大豆肽作為其衍生物，具有抗氧化、降血壓等生理活性[10-11]，且具備良好的金屬螯合特性[12-14]。

目前，大豆肽鋅螯合物由于鋅螯合率較低、螯合機(jī)制不清等問題限制了其商業(yè)化應(yīng)用。此外，研究者對大豆肽鋅螯合物的消化吸收特性研究較少，無法比較螯合態(tài)鋅與傳統(tǒng)無機(jī)鋅鹽的生物利用率差異，肽鋅螯合物的消化吸收效果有待深入闡述。作者以酶解法制備大豆肽，通過螯合反應(yīng)制備大豆肽鋅螯合物，并優(yōu)化制備條件；利用多種光譜學(xué)技術(shù)對大豆肽螯合鋅前后進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；進(jìn)一步通過體外模擬消化研究大豆肽鋅螯合物的胃腸溶解性和腸道透過率，評價其生物利用度。該研究對提高大豆蛋白的利用價值具有重要意義，并為新型鋅營養(yǎng)補(bǔ)充劑的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆分離蛋白：鯤華生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶(Alcalase)：丹麥諾維信公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶：索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、六亞甲基四胺(EDTA)、二甲酚橙、七水合硫酸鋅：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療器材有限公司；GL-1000C高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器公司；Alpha 1-2LD plus冷凍干燥機(jī)：德國Christa公司；EVO18掃描電鏡：德國卡爾蔡司股份公司；Hyperion 2000傅里葉紅外光譜儀：德國布魯克公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選制備大豆肽的蛋白酶

將大豆分離蛋白和磷酸鹽緩沖溶液以1∶20(g/mL)混合，分別加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)至酶的最適溫度和pH值，酶解4 h后加熱滅酶(90 ℃，15 min)，將酶解液pH值調(diào)至7.0，然后離心(5 000 r/min，20 min)取上清液測水解度，冷凍干燥即得大豆肽。以大豆肽鋅螯合能力為指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.2 肽鋅螯合物的制備

參考王晴等[12]的方法，取凍干后的大豆肽粉溶于去離子水配制大豆肽溶液，并加入一定比例七水合硫酸鋅，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為5.0，50 ℃下充分?jǐn)嚢? h，離心(5 000 r/min，10 min)除去雜質(zhì)。上清液中加入3倍體積的無水乙醇，離心(3 500 r/min，15 min)取沉淀冷凍干燥。

1.2.3 優(yōu)化制備大豆肽的酶解條件

通過酶解制備大豆肽，分別對酶解pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量和時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以鋅螯合率為指標(biāo)，優(yōu)化制備大豆肽的酶解條件。

1.2.4 水解度(DH)的測定

參照王進(jìn)[13]的方法，采用茚三酮比色法。

1.2.5 鋅螯合率的測定

參照Wang等[14]的方法，采用EDTA絡(luò)合滴定法。

式中：C為EDTA溶液的濃度，mol/L；V總為測定總鋅含量時消耗的EDTA體積，mL；V螯合為測定螯合鋅含量時消耗的EDTA體積，mL；V空白為用去離子水代替待測液所需的EDTA體積，mL。

1.2.6 優(yōu)化螯合條件

取凍干后的大豆肽粉和硫酸鋅溶于去離子水，按照1.2.2中方法制備大豆肽鋅螯合物，對螯合反應(yīng)的肽鋅質(zhì)量比、pH值、溫度和時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。依據(jù)大豆肽鋅螯合單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。以鋅螯合率為指標(biāo)，確定制備大豆肽鋅螯合物的最佳工藝條件。

1.2.7 大豆肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.2.7.1 掃描電鏡分析

將大豆肽與肽鋅螯合物樣品置于鋁制樣品臺上，噴金鍍膜處理后，在掃描電鏡放大倍數(shù)為1 000～3 000倍下拍攝樣品圖像。

1.2.7.2 傅里葉變換紅外光譜分析

分別取1 mg大豆肽和肽鋅螯合物樣品與100 mg干燥的溴化鉀混合研磨，采用壓片法在500～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描測定。

1.2.8 肽鋅螯合物的體外消化分析

參考Wang等[15]的方法。配制模擬胃液：稱取0.2 g NaCl與0.32 g胃蛋白酶，將pH值調(diào)至2.0，定容至100 mL。配制模擬腸液：稱取0.68 g的KH2PO4溶于70 mL雙蒸水，加入1 g胰蛋白酶和6 g膽鹽，將pH值調(diào)至7.6，定容至100 mL。

按照樣品∶模擬胃液體積比為10∶1加入模擬胃液，在pH 2.0、37 ℃下消化120 min。隨后調(diào)pH值至7.6，按照樣品∶模擬胰液體積比為10∶1加入模擬胰液，將此混合物移入透析袋(7 000 Da)，37 ℃水浴振蕩120 min。取等體積的胃、腸消化液離心(8 000 r/min，15 min)，用EDTA絡(luò)合滴定法測定上清液和混合物溶液中鋅含量，計(jì)算鋅離子溶解率。

鋅離子溶解率=V1/V2×100%，

式中：V1和V2分別為滴定上清液和混合物溶液中鋅離子所需的EDTA溶液體積，mL。

經(jīng)腸液消化后，取透析袋外的溶液，用絡(luò)合滴定法測定鋅離子含量時所需EDTA體積計(jì)算鋅透過率。

鋅透過率=V1/V2×100%，

式中：V1和V2分別為滴定透析袋外溶液和混合物溶液中鋅離子所需的EDTA溶液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0、Origin 9.0分析數(shù)據(jù)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選制備大豆肽的蛋白酶

由圖1可知，大豆分離蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后的酶解物鋅螯合率高于其他蛋白酶，酶解4 h的大豆肽鋅螯合率達(dá)到52.50%。Wang等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)：不同蛋白酶水解乳清蛋白和鱈魚皮明膠蛋白后的金屬螯合能力不同，經(jīng)胰蛋白酶水解后的酶解物均具有較高金屬螯合活性，與本文結(jié)果相似。蛋白質(zhì)酶解物的生物活性取決于底物、酶的種類、水解程度[18]。不同酶水解后產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物和鋅結(jié)合能力的差異歸因于酶在蛋白質(zhì)鏈上不同的切割位置。胰蛋白酶作為一種內(nèi)肽酶，可高效識別并切割賴氨酸和精氨酸殘基的羧基端[19]。肽鏈中的天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸被認(rèn)為是金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)[5]。因此，選取胰蛋白酶進(jìn)行下一步的研究。

長江擁有獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)，是我國重要的生態(tài)寶庫。長江全長6 300km，蜿蜒貫穿中國大陸地勢的三級階梯，流域遼闊，地貌和地質(zhì)條件差異大，各地氣候多樣、獨(dú)特；從高原到河口有成千上萬條支流匯入，中下游地區(qū)歷史上有眾多湖泊與長江相通，水系發(fā)達(dá)，徑流充足，形成了滿足不同生物生長、繁衍的條件，生物多樣性極其豐富。

2.2 優(yōu)化制備大豆肽的酶解條件

為得到具有高鋅螯合活性的大豆肽，通過單因素試驗(yàn)，分別研究了酶解pH值、溫度、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量和時間對酶解產(chǎn)物水解度和鋅螯合率的影響。由圖2A可知，當(dāng)酶解pH值從6.5增加到8.0時，水解度和鋅螯合能力不斷提高，pH 8.0時水解度和鋅螯合率最高，分別為10.82%和52.17%。但隨著pH值進(jìn)一步升高，水解度和鋅螯合能力下降。由圖2B可知，水解度在35～50 ℃范圍內(nèi)逐漸增加，于50 ℃達(dá)到最高值10.96%，進(jìn)一步升溫則水解度降低。由于蛋白酶在最適溫度下酶活力最高，當(dāng)溫度過高或過低時，都會造成酶的構(gòu)象改變，使酶活力降低，導(dǎo)致水解度下降[20]。大豆肽的鋅螯合率受酶解溫度影響較小并不顯著，但也呈先增加后減小的趨勢，在45 ℃時螯合率最高為54.16%。故選擇45 ℃作為最優(yōu)酶解溫度，不再作為正交試驗(yàn)的因素。

由圖2C可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，水解度和鋅螯合率均先增加后降低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時，水解度達(dá)到最高值11.16%，鋅螯合率達(dá)到最高值56.45%，因此選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%進(jìn)行下一步優(yōu)化。由圖2D可知，隨著加酶量增加，水解度和鋅螯合率先增加后趨于穩(wěn)定。當(dāng)加酶量為5%時，鋅螯合率達(dá)到54.16%，此時水解度為10.17%，繼續(xù)增加酶用量鋅螯合率無顯著變化，故選取加酶量5%進(jìn)行下一步優(yōu)化。由圖2E可知，在1～4 h的反應(yīng)期間，水解度和鋅螯合率均呈現(xiàn)增加的趨勢，在4 h時鋅螯合率最大，為56.52%，因此選取酶解4 h進(jìn)行下一步研究。隨后水解度緩慢增加，在5 h時達(dá)到最高值12.29%，而鋅螯合能力降低。研究表明鋅螯合能力隨著水解時間的延長而增加，但過度水解導(dǎo)致鋅螯合能力降低[21]。

2.3 酶解制備大豆肽正交試驗(yàn)結(jié)果

選取對鋅螯合率影響較大的4個因素(酶解pH值、時間、加酶量和底物質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示，由表1可知，對鋅螯合率的影響因素依次為酶解pH值>時間>加酶量>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。最佳酶解條件為A2B2C3D2，即pH 8.0，反應(yīng)時間4 h，加酶量6%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%。在最佳條件下對其進(jìn)行驗(yàn)證，得到鋅螯合率為59.37%，優(yōu)于正交試驗(yàn)中的結(jié)果，故選用該條件制備大豆肽進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 酶解條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 優(yōu)化大豆肽鋅螯合物的螯合條件

在肽鋅螯合反應(yīng)的條件優(yōu)化中，分別研究了肽鋅質(zhì)量比、pH值、溫度和時間對鋅螯合率的影響。由圖3A可知，鋅螯合能力隨著多肽比例的增大而先提高后降低，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到4∶1時，大豆肽的鋅螯合率為74.90%，繼續(xù)增加肽鋅質(zhì)量比，螯合能力開始下降。表明反應(yīng)在肽鋅比4∶1時達(dá)到平衡，當(dāng)肽鋅比繼續(xù)增加則溶液中大豆肽會發(fā)生聚集，不利于與鋅離子結(jié)合。由圖3B可知，隨著pH值從3.0升高到5.0，鋅螯合率逐漸增加至76.61%，當(dāng)pH值超過5.0時迅速降低。這是由于反應(yīng)體系在酸性條件下，溶液中H+與金屬陽離子競爭結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致鋅螯合率較低；適當(dāng)增加pH值則鋅螯合率提高，當(dāng)pH大于5.0時，Zn2+在反應(yīng)體系中更容易與OH-結(jié)合形成Zn(OH)2沉淀，從而降低螯合率[22]。

由圖3C可知，大豆肽的鋅螯合能力隨著溫度升高而增加，60 ℃時鋅螯合率達(dá)到82.80%，超過60 ℃時螯合率降低。由于溫度會影響肽鋅螯合物的反應(yīng)速率，初期溫度上升會促進(jìn)螯合反應(yīng)，與富天昕等[23]的研究結(jié)果相似。由圖3D可知，隨著螯合反應(yīng)時間的延長，大豆肽的鋅螯合率不斷升高，反應(yīng)60 min時螯合率最高可達(dá)80.76%，繼續(xù)延長時間則其螯合能力略有降低。由于螯合時間對其螯合率的影響并不顯著，故選取60 min作為最優(yōu)反應(yīng)時間，不再作為正交試驗(yàn)的因素。

2.5 螯合條件正交試驗(yàn)結(jié)果

選取對鋅螯合率影響較大的3個因素(肽鋅質(zhì)量比、pH值、溫度)進(jìn)行螯合條件正交試驗(yàn)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示，由表2可知,對鋅螯合率的影響依次為肽鋅質(zhì)量比>溫度>pH值。最佳螯合反應(yīng)條件為A2B2C2，即肽鋅質(zhì)量比4∶1，pH 5.0，溫度60 ℃，反應(yīng)時間60 min。在最佳條件下對其進(jìn)行驗(yàn)證，得到鋅螯合率為82.22%，優(yōu)于高素蘊(yùn)等[11]用堿性蛋白酶水解制備大豆肽的鋅螯合率。

表2 螯合條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6 大豆肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 掃描電子顯微鏡分析

2.6.2 傅里葉變換紅外光譜分析

2.7 體外模擬胃腸道消化

為研究鋅在人體胃腸道的消化吸收特性，通過模擬體外消化來評估大豆肽鋅螯合物和ZnSO4在胃腸道的溶解性。此外，還研究了消化時間對鋅在腸道溶解率的影響。由圖6可知，在胃消化階段，ZnSO4和大豆肽鋅螯合物的溶解率均處于較高水平，分別大于或等于92.85%、90.19%。進(jìn)入腸道消化階段，大豆肽鋅螯合物的溶解率下降到54.34%，而ZnSO4的溶解率顯著下降到20.21%。在體外模擬胃腸道消化階段，大豆肽鋅螯合物的鋅溶解程度均高于ZnSO4。試驗(yàn)結(jié)果表明，在胃腸道的酸堿度范圍內(nèi)，較高的螯合態(tài)鋅含量對于改善人體胃腸道生理環(huán)境中的鋅離子生物利用度很重要。在pH 2.0的胃環(huán)境下，螯合態(tài)鋅有利于鋅向腸環(huán)境的轉(zhuǎn)運(yùn)；在pH 7.6的堿性腸道環(huán)境中，螯合態(tài)鋅可以防止鋅產(chǎn)生沉淀，從而使其可以被腸上皮細(xì)胞有效吸收[22]。此外，由于肽鋅螯合物具有一定緩沖作用，能避免與飲食中植酸形成不溶性復(fù)合物，可以顯著提高鋅的生物利用率[27]。

由圖7可知，大豆肽鋅螯合物的鋅透過率從34.78%上升到51.02%，顯著高于ZnSO4的鋅透過率。試驗(yàn)表明，由于大豆肽鋅螯合物可以部分抵抗腸道堿性條件，減少形成氫氧化鋅沉淀，在模擬腸道消化結(jié)束后，有超過1/2的鋅離子被吸收。此外，大豆肽鋅螯合物可在胃/胰蛋白酶作用下進(jìn)一步分解為小分子，重新進(jìn)入腸道被吸收[28]，并可能增加鋅的吸收和生物利用度。綜上，大豆肽鋅螯合物在模擬腸道中的鋅溶解率和鋅透過率均高于無機(jī)鋅鹽，是一種優(yōu)良的新型鋅補(bǔ)充劑。

3 結(jié)論

本研究將大豆肽與鋅離子進(jìn)行螯合，以鋅螯合率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)獲得酶解制備大豆肽的最優(yōu)條件為酶解溫度45 ℃、pH 8.0、胰蛋白酶加酶量6%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、時間4 h；肽鋅螯合的最優(yōu)條件為肽鋅質(zhì)量比4∶1、溫度60 ℃、pH 5.0、時間60 min，該條件下的鋅螯合率可達(dá)82.22%。對大豆肽螯合前后進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)，鋅的配合導(dǎo)致了大豆肽和螯合物的結(jié)構(gòu)差異，使大豆肽鋅螯合物在掃描電鏡圖譜中呈現(xiàn)均勻疏松的微觀結(jié)構(gòu)。肽鏈中的羧基氧原子和氨基氮原子是鋅和大豆肽相互作用的重要位點(diǎn)。此外，大豆肽鋅螯合物具有優(yōu)于無機(jī)鋅鹽的胃腸溶解性和腸道透過率，可能增加鋅的生物利用度。大豆肽鋅螯合物是一種優(yōu)良的新型補(bǔ)鋅劑，可以替代目前的無機(jī)鋅鹽補(bǔ)充劑，具有潛在的應(yīng)用價值。