張明明，馬衛(wèi)賓,2，王 沖，謝巖黎*

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

黃曲霉菌(Aspergillusflavus)是糧油儲(chǔ)藏中常見致病菌之一，能產(chǎn)生毒性極強(qiáng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)，對(duì)人和動(dòng)物的肝臟有致癌、致畸和致突變性[1]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)定為Ⅰ類致癌物[2]。黃曲霉菌極易在糧食的播種、收獲、運(yùn)輸及儲(chǔ)藏過程中污染農(nóng)作物，尤其是花生、玉米等油料作物[3]，不僅會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，還能通過黃曲霉毒素在食物鏈中積累引起嚴(yán)重的食品安全問題，最終危害人類健康[4]。我國作為糧食生產(chǎn)和消費(fèi)大國，致力于尋找安全高效的方法控制黃曲霉菌污染，以保障糧食安全和食品安全[5]。

目前普遍使用人工合成殺菌劑控制產(chǎn)毒真菌，但由于其降解時(shí)間長、有毒物殘留和對(duì)人類健康有潛在影響，因此國內(nèi)外研究者開始致力于從天然化合物中尋找安全、高效、經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的新型抑菌物質(zhì)替代傳統(tǒng)防腐劑。目前已鑒定出多種天然抑菌物質(zhì)，主要存在于植物香料中，一些植物精油或成分(如姜黃精油[6]、孜然精油[7])已經(jīng)被開發(fā)成為食品抑菌劑。天然酚類香料也主要來源于植物，成分相對(duì)安全，在改善食品風(fēng)味的同時(shí)，還可發(fā)揮殺菌、防腐的作用[8]，在20世紀(jì)初被作為防腐劑添加在食品中。多數(shù)酚類香料被報(bào)道具有較好的抑菌活性，如丁香酚[9-10]、香芹酚[11]和百里香酚[12]等。Payne等[13]發(fā)現(xiàn)特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)和對(duì)羥基苯甲酸丙酯對(duì)李斯特菌的抑制效果都明顯高于常用食品抗菌劑山梨酸鉀。孫潔雯等[14]報(bào)道了23種酚類香料對(duì)4種常見細(xì)菌的抑菌活性，其中2-丙基苯酚、2-異丙基苯酚、4-丙基苯酚、香芹酚和百里香酚對(duì)4種供試細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌效果。然而關(guān)于4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌的熏蒸抑菌活性未見有研究報(bào)道。4-丙基苯酚是GB 2760—2014中允許添加的食品香料，在食用安全性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

本文以常用防腐劑山梨酸為陽性對(duì)照，篩選了國家標(biāo)準(zhǔn)中允許使用的7種酚類食品香料并對(duì)活性較好的4-丙基苯酚進(jìn)行了研究，進(jìn)一步分析其對(duì)黃曲霉菌的抑菌活性以及在花生儲(chǔ)藏中的應(yīng)用效果，為開發(fā)安全、高效的天然防腐劑或糧食防霉劑提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2-丙基苯酚、4-丙基苯酚、2-異丙基苯酚、茶多酚、百里香酚、麥芽酚、乙基麥芽酚等酚類食品香料：上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；吐溫80(化學(xué)純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；黃曲霉菌(CGMCC 3.6304)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

沙氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、瓊脂20 g、葡萄糖40 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；XK96-A/B快速混勻器：江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-20 雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及孢子懸浮液的制備

將黃曲霉菌接種于沙氏培養(yǎng)基上，(28±2)℃培養(yǎng)7 d，使用含0.1%吐溫80的生理鹽水洗脫并通過3層擦鏡紙過濾菌絲得到孢子懸浮液[15]，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)黃曲霉菌孢子，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至106～108個(gè)/mL。

1.3.2 帶藥培養(yǎng)基法測(cè)定抑菌活性

參考Li等[16]使用的方法并稍做修改。根據(jù)設(shè)定濃度梯度，稱取相應(yīng)質(zhì)量的酚類化合物，加入含10%吐溫80的乙醇溶液(吐溫80與無水乙醇體積比1∶9)中渦旋混勻，制成化合物母液。吸取1 mL母液滴加到無菌培養(yǎng)皿中與19 mL滅菌沙氏培養(yǎng)基混勻，冷凝后備用，吸取3 μL黃曲霉菌孢子懸浮液(108個(gè)/mL)接種至培養(yǎng)基中間，在(28±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。酚類香料篩選質(zhì)量濃度為0.2、0.4 mg/mL。選4-丙基苯酚質(zhì)量濃度為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL研究其最小抑菌濃度。未經(jīng)酚類香料處理的培養(yǎng)皿(20 mL滅菌培養(yǎng)基)作為空白對(duì)照(CK)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，十字交叉法測(cè)量真菌生長直徑。計(jì)算黃曲霉菌生長抑制率。

生長抑制率=(dc-dt)/dc×100%，

式中：dc、dt分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組中黃曲霉菌生長平均直徑，cm。

1.3.3 密閉熏蒸法測(cè)定4-丙基苯酚抑菌活性

參考 Boukaew等[17]使用的方法，在培養(yǎng)皿中倒入20 mL滅菌的沙氏培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷凝后，吸取3 μL黃曲霉菌孢子懸浮液滴在培養(yǎng)基中間，將4-丙基苯酚添加到培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)的滅菌濾紙條上迅速密封，其在培養(yǎng)皿內(nèi)的熏蒸質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL(化合物質(zhì)量/培養(yǎng)皿內(nèi)空氣體積)。(28±2)℃培養(yǎng)6 d，抑菌活性測(cè)定方法同1.3.2。

1.3.4 4-丙基苯酚對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌的熏蒸抑菌活性

參考Prakash等[18]使用的方法，挑選顆粒飽滿無霉菌污染的花生，75%酒精浸泡30 s，用無菌水漂洗4次去掉殘留酒精。再將花生在黃曲霉菌孢子液中浸泡30 s，放置于超凈工作臺(tái)的無菌濾紙上，待其表面無殘留流動(dòng)液體，平放到培養(yǎng)皿中備用(每皿10～12粒)。添加4-丙基苯酚于培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)的滅菌濾紙上，熏蒸質(zhì)量濃度為0.2、0.5、0.8、1.1 mg/mL，滴加4-丙基苯酚后立即密封，(28±2)℃培養(yǎng)7 d。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每隔24 h，統(tǒng)計(jì)花生污染黃曲霉數(shù)量?；ㄉ棺兟?污染的花生數(shù)量/花生總數(shù)量×100%。

1.3.5 4-丙基苯酚對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌的熏蒸殺菌活性

按照1.3.4方法準(zhǔn)備花生樣品，使無菌濾紙片上4-丙基苯酚的熏蒸濃度為0.8、1.1、1.4、1.7 mg/mL，(28±2)℃培養(yǎng)24 h后將花生移到新的滅菌培養(yǎng)皿中，密封后繼續(xù)培養(yǎng)6 d。每隔24 h記錄花生霉變數(shù)量，并計(jì)算霉變率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 Origin 8.5和SPSS 20.0進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種酚類香料對(duì)黃曲霉菌生長的抑制活性

由表1可知，除麥芽酚外，大多數(shù)酚類香料對(duì)黃曲霉菌有不同的抑制效果。在0.2 mg/mL篩選質(zhì)量濃度下，乙基麥芽酚、茶多酚、麥芽酚3種化合物抑菌率均為0%，4-丙基苯酚顯示出良好的抑菌效果，抑制率為54.10%，約為陽性對(duì)照山梨酸(22.90%)的2倍。供試化合物在0.4 mg/mL時(shí)，抑制率較0.2 mg/mL時(shí)均有所升高，4-丙基苯酚、2-異丙基苯酚和2-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌的抑制效果最強(qiáng)，抑制率均為100%；其次是百里香酚，抑制率為90.10%；作為陽性對(duì)照，山梨酸的抑制率為60.10%；乙基麥芽酚和茶多酚的抑菌活性較弱，抑制率分別為23.30%和1.80%。抑菌活性篩選結(jié)果表明，供試的7種酚類食品香料中，4-丙基苯酚的抑菌效果最好，且明顯優(yōu)于陽性對(duì)照山梨酸。

表1 7種酚類香料對(duì)黃曲霉菌生長的抑制活性(7 d)

2.2 4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌的最小抑菌濃度

采用帶藥培養(yǎng)基法，通過研究不同質(zhì)量濃度4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌絲生長的抑制作用，確定最小抑菌濃度。由圖1a可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，黃曲霉菌落直徑不斷增大。與CK組相比，4-丙基苯酚在不同質(zhì)量濃度下均可以延緩黃曲霉菌絲生長，且延緩程度呈濃度依賴性。質(zhì)量濃度為0.25、0.30 mg/mL時(shí)，菌絲延遲生長了2～5 d，且培養(yǎng)6 d的菌落直徑與CK組培養(yǎng)1 d的直徑大小相當(dāng)。濃度為0.35、0.40 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)期間未見黃曲霉菌生長。

由圖1b可知，4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉生長的抑制效果呈劑量依賴性。當(dāng)4-丙基苯酚質(zhì)量濃度為0.20～0.30 mg/mL時(shí)，對(duì)黃曲霉的生長有不同程度的抑制作用，抑制率為54.1%～90.6%；當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增大到0.35 mg/mL及以上時(shí)，可完全抑制黃曲霉菌絲生長，抑制率達(dá)100%，由此可知4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉的MIC為0.35 mg/mL。

2.3 4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌的熏蒸抑制作用

由圖2a可知，與CK組相比，密閉熏蒸條件下不同質(zhì)量濃度的4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌絲生長均具有一定的抑制作用，且隨著熏蒸質(zhì)量濃度的增大，對(duì)黃曲霉生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在0.02、0.03 mg/mL質(zhì)量濃度下，與CK組相比，菌絲生長延遲了1 d；0.04、0.05 mg/mL處理時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)6 d黃曲霉菌落直徑為0，其生長完全被抑制。

由圖2b可知，4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉的熏蒸抑制作用與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在0.01、0.02、0.03 mg/mL質(zhì)量濃度下的抑制率分別為14.4%、38.8%和91.6%；4-丙基苯酚質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 mg/mL及以上時(shí)，黃曲霉生長完全被抑制。由此可見，熏蒸條件下4-丙基苯酚對(duì)黃曲霉菌的MIC為0.04 mg/mL。此外，與帶藥培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果相比，4-丙基苯酚在密閉熏蒸法中可在較低濃度下抑制黃曲霉生長，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌效果，其原因可能與供試化合物在熏蒸條件下對(duì)微生物細(xì)胞具有更強(qiáng)的滲透作用有關(guān)[19]。

2.4 4-丙基苯酚對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌生長的熏蒸抑制作用

由圖3a可知，不同質(zhì)量濃度的4-丙基苯酚對(duì)儲(chǔ)藏花生中的黃曲霉菌有一定的熏蒸抑制效果，且呈劑量依賴性。隨著花生的儲(chǔ)藏時(shí)間延長，霉變率不斷升高；同時(shí)隨著4-丙基苯酚質(zhì)量濃度的升高，黃曲霉菌對(duì)花生的污染率出現(xiàn)不同程度的降低，7 d時(shí)，在0.2、0.5、0.8 mg/mL質(zhì)量濃度下，花生霉變率分別為100%、72.7%、18.2%；1.1 mg/mL質(zhì)量濃度下，花生的黃曲霉菌污染率為0%。圖3b為4-丙基苯酚抑制黃曲霉菌污染花生的實(shí)物圖，由圖3b可以看出，4-丙基苯酚能有效抑制黃曲霉菌的生長，熏蒸質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時(shí)，花生上的黃曲霉菌明顯變少，達(dá)到1.1 mg/mL時(shí)，花生上的黃曲霉菌生長完全被抑制，表明4-丙基苯酚熏蒸處理對(duì)儲(chǔ)藏中花生的MIC為1.1 mg/mL。

2.5 4-丙基苯酚對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌生長的熏蒸殺菌活性

由圖4a可知，4-丙基苯酚對(duì)花生中黃曲霉菌的污染具有顯著的抑制效果。4-丙基苯酚熏蒸質(zhì)量濃度為0.8、1.4 mg/mL時(shí)，儲(chǔ)藏前熏蒸處理24 h能夠在一定程度上延遲黃曲霉菌對(duì)花生的侵染，與CK相比可延遲1～2 d。質(zhì)量濃度達(dá)到1.7 mg/mL時(shí)，儲(chǔ)藏期間花生未發(fā)生霉變，表明在此質(zhì)量濃度下熏蒸24 h可將花生上的黃曲霉菌孢子完全殺死，有效防止黃曲霉菌在花生上的侵染和生長。圖4b為4-丙基苯酚熏蒸處理對(duì)花生中黃曲霉菌的殺菌效果實(shí)物圖，可以看出，隨著4-丙基苯酚質(zhì)量濃度的增加，花生霉變率開始下降；當(dāng)達(dá)到1.7 mg/mL時(shí)，可以完全抑制黃曲霉菌在花生上的生長，表明4-丙基苯酚熏蒸24 h對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌的MFC為1.7 mg/mL。

3 結(jié)論

本文研究了7種酚類食品香料對(duì)黃曲霉菌的抑制效果，通過帶藥培養(yǎng)基法的篩選，多數(shù)酚類香料表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中4-丙基苯酚效果最好，且明顯優(yōu)于陽性對(duì)照山梨酸。在此基礎(chǔ)上，通過接觸和熏蒸2種方式進(jìn)一步研究了4-丙基苯酚在不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果，結(jié)果顯示4-丙基苯酚在接觸和熏蒸的條件下對(duì)黃曲霉生長的MIC分別為0.35 mg/mL和0.04 mg/mL，表明在熏蒸條件下對(duì)黃曲霉菌具有更好的抑制效果。此外，研究 4-丙基苯酚對(duì)花生儲(chǔ)藏中黃曲霉菌污染的控制效果時(shí)發(fā)現(xiàn)熏蒸質(zhì)量濃度為1.1 mg/mL時(shí)，4-丙基苯酚能夠完全抑制黃曲霉菌孢子在花生上的侵染，1.7 mg/mL熏蒸24 h可將花生上的黃曲霉菌孢子完全殺死。因此，4-丙基苯酚對(duì)花生儲(chǔ)藏中的黃曲霉菌污染具有很好的控制作用，有望開發(fā)成一種新型、安全、環(huán)保的糧食防霉劑或食品防腐劑，拓寬了其在食品中的應(yīng)用范圍和用途。目前關(guān)于酚類香料的抑菌機(jī)理尚不明確，Shen等[20]發(fā)現(xiàn)百里香酚處理能夠誘導(dǎo)黃曲霉菌孢子產(chǎn)生過量的ROS和NO，最終導(dǎo)致黃曲霉死亡。此外，Dambolena等[21]指出親脂性是酚類化合物抗真菌活性的關(guān)鍵特性，且酚類抗菌劑的作用機(jī)理與引起細(xì)胞膜受損以及營養(yǎng)物質(zhì)滲漏從而導(dǎo)致微生物死亡有關(guān)。4-丙基苯酚具有開發(fā)成為天然、環(huán)保、安全的防腐防霉劑的潛力，目前還未有其抑菌機(jī)理的相關(guān)報(bào)道，值得進(jìn)一步深入研究。