低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)快速鑒別花生油真?zhèn)?/h1>
2022-10-10 11:39:18楊嘉盛任一飛史翠熠陳名揚(yáng)
彭 丹，楊嘉盛，任一飛，史翠熠，陳名揚(yáng)
1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.中糧東海糧油工業(yè)有限公司，江蘇 張家港 215634
花生油以其氣味芳香、營養(yǎng)均衡而深受消費(fèi)者的喜愛。隨著花生油價(jià)格和需求量不斷升高[1]，市場(chǎng)上以假亂真現(xiàn)象頻頻發(fā)生，一些不法生產(chǎn)經(jīng)營者為牟取暴利，將劣質(zhì)油或低價(jià)油摻入花生油中，損害消費(fèi)者的健康和利益。
目前，國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 1534—2017《花生油》和GB/T 5539—2008《糧油檢驗(yàn) 油脂定性試驗(yàn)》)中未規(guī)定食用油真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法，僅規(guī)定了花生油感官評(píng)價(jià)(氣滋味、色澤、狀態(tài))、理化指標(biāo)(酸價(jià)、過氧化值、折射率等)的要求。實(shí)際檢測(cè)中，感官評(píng)價(jià)易受操作人員的影響，理化指標(biāo)測(cè)定費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、易接觸有毒溶劑，最大的問題是無法準(zhǔn)確鑒別油脂的真?zhèn)?。因此，開發(fā)一種新型、快速、環(huán)保的食用油摻偽檢測(cè)方法非常必要。
近年來，油脂摻偽檢測(cè)方法的研究主要集中于氣相色譜法[2]、近紅外光譜法[3]、紫外光譜法[4]、同位素法[5]、熒光光譜法[6]、拉曼光譜法[7]等。氣相色譜法靈敏度高，但分析過程復(fù)雜，包括多步樣品前處理及有機(jī)溶劑使用；近紅外光譜法具有快速、無損等優(yōu)點(diǎn)，但需要大量代表性樣品建模；紫外光譜法、熒光光譜法檢測(cè)成本低，但模型穩(wěn)定性較差；同位素法、拉曼光譜法儀器昂貴，技術(shù)還不夠成熟。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)作為一種新興便捷、低成本的檢測(cè)方法，具有快速、無損、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)，LF-NMR的CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)回波數(shù)據(jù)、縱向弛豫時(shí)間(T1)、橫向弛豫時(shí)間(T2)及擴(kuò)散系數(shù)等信息可以反映待測(cè)樣品內(nèi)部自旋核子種類及其所處的狀態(tài)，與樣品品質(zhì)有顯著的相關(guān)性[8]。油脂是脂肪酸甘三酯的混合物，脂肪酸占95%左右，不同油脂在脂肪酸種類和含量方面是有區(qū)別的。油脂中存在大量的氫質(zhì)子，其狀態(tài)及所處的物理化學(xué)環(huán)境不同，弛豫時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度亦有所不同。目前低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在油脂檢測(cè)中的應(yīng)用主要為固體脂肪含量測(cè)定、煎炸油品質(zhì)判斷和極性組分定量檢測(cè)。徐愛軍等[9]考察了影響低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)固體脂肪含量的主要因素。王永巍等[10]研究了煎炸過程中低場(chǎng)核磁弛豫特性與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性。Wang等[11]、Sun等[12]通過低場(chǎng)核磁弛豫特性對(duì)油脂煎炸過程中極性組分進(jìn)行了定量檢測(cè)。Zhang等[13]、Lu等[14]利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)識(shí)別合格植物油和煎炸老油。Hou等[15]、趙婷婷等[16]利用LF-NMR弛豫圖譜對(duì)不同植物油種類進(jìn)行了鑒別。周凝等[17]通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)研究米糠毛油摻偽，發(fā)現(xiàn)米糠毛油在10 ms處存在特征弛豫峰。然而，LF-NMR技術(shù)檢測(cè)油脂摻偽尚處于起步階段，特別是摻入低價(jià)植物油情況目前的研究較少。
基于此，本研究從單一種類和等級(jí)的摻偽花生油(大豆油、玉米油)入手，采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(聚類分析、支持向量機(jī))對(duì)花生油真?zhèn)舞b別的可行性進(jìn)行研究，旨在為油脂真?zhèn)慰焖勹b別及其品質(zhì)分析提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
不同產(chǎn)地和批次的花生油(56種)、大豆油(5種)和玉米油(5種)均購于鄭州大型超市或生產(chǎn)廠家。正己烷(色譜純)、乙醚、異丙醇、甲醇鈉、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、酚酞、可溶性淀粉、無水硫酸鈉等，除特殊標(biāo)注外，均為分析純。
摻偽花生油樣品的配制：將植物油按5%、10%、15%、20%、30%、40%、60%和80%(以植物油質(zhì)量占油脂總質(zhì)量的百分比計(jì))摻入花生油中共配制400個(gè)摻假花生油樣品，對(duì)油樣進(jìn)行編號(hào)。以H2D3-5%為例，H2表示2號(hào)花生油，D3表示3號(hào)大豆油，5%表示5%的摻偽比例。對(duì)建模樣本按照3∶1隨機(jī)劃分為校正集和預(yù)測(cè)集樣本。
1.2 儀器設(shè)備
低場(chǎng)核磁共振分析儀：德國Bruker公司；XW-80A漩渦混合器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；SD制冷加熱循環(huán)水?。好绹鳳olyscience公司；BSA224 S分析天平：德國Sartorius公司；Agilent 8860氣相色譜儀：美國Agilent公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定
酸價(jià)測(cè)定：參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；過氧化值測(cè)定：參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》。
1.3.2 脂肪酸組成分析
脂肪酸組成分析：油樣先甲酯化再進(jìn)入氣相色譜儀中測(cè)定，具體方法參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》。
氣相色譜條件：BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×25.0 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫170 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300 ℃；分流比20∶1；氮?dú)饬魉? mL/min；氫氣流速30 mL/min；空氣流速400 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。
1.3.3 低場(chǎng)核磁回波衰減曲線測(cè)定
準(zhǔn)確量取3 mL樣品移入核磁共振專用試管中，45 ℃水浴以保證樣品狀態(tài)一致性，然后置于樣品槽中進(jìn)行測(cè)定。利用低場(chǎng)核磁共振分析儀測(cè)定樣品的CPMG回波衰減曲線。儀器參數(shù)設(shè)置：采樣頻率200 kHz，重復(fù)采樣時(shí)間1 s，半回波時(shí)間0.5 ms，回波個(gè)數(shù)3 000個(gè)，重復(fù)掃描8次。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。
1.4 數(shù)據(jù)處理
利用主成分分析(PCA)對(duì)油樣的低場(chǎng)核磁回波衰減曲線數(shù)據(jù)降維，同時(shí)對(duì)花生油及摻偽花生油進(jìn)行判別，具體處理過程參見文獻(xiàn)[18]。采用聚類分析(CA)對(duì)花生油摻偽進(jìn)行定性分析，通過支持向量機(jī)(SVM)建立判別模型，并與CA法進(jìn)行比較。CA是一種無監(jiān)督的方法，其基本思想：每個(gè)樣本都自成為一類，規(guī)定類與類之間的距離，選擇距離最小的一對(duì)合并成為一類，依次類推，直至所有的樣本都聚為一類為止，然后再根據(jù)一定的原則如標(biāo)準(zhǔn)值或經(jīng)驗(yàn)，選取合適的分離閾值確定最終分類結(jié)果[19]。SVM是利用非線性函數(shù)將樣本映射到高維特征空間，根據(jù)結(jié)構(gòu)分析最小化原則，在高維特征空間中尋找最優(yōu)超平面，解決分類問題[20]。在SVM建模過程中，核函數(shù)及其參數(shù)選擇參照文獻(xiàn)[21]。以上數(shù)據(jù)處理均采用The Unscrambler X 10.4軟件完成，所得數(shù)據(jù)用Origin 2021b軟件進(jìn)行圖形繪制。
2 結(jié)果與討論
2.1 油脂理化指標(biāo)和脂肪酸組成分析
對(duì)花生油和摻偽植物油的理化指標(biāo)和脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1和表2。由表1可知，花生油和摻偽植物油的色澤和氣味均符合國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2716—2018)，其酸價(jià)和過氧化值均在國標(biāo)規(guī)定范圍內(nèi)。從表2脂肪酸組成上可以看出，花生油與其他摻偽植物油的主要脂肪酸基本一致，即棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)，其含量占總脂肪酸含量的90%以上，但受產(chǎn)地、氣候、加工工藝等因素影響，同種油脂的脂肪酸組成及含量存在一定的差異；花生油油酸含量較高屬于油酸型油脂，而大豆油和玉米油則屬于亞油酸型油脂；花生油中長碳鏈脂肪酸，如花生酸、山崳酸、木焦油酸等的含量明顯高于其他摻偽植物油，而亞麻酸并未檢出。花生油的單不飽和脂肪酸含量為46%～51%，明顯高于其他油脂；而大豆油和玉米油脂肪酸組成較為相似，多不飽和脂肪酸含量均大于53%，遠(yuǎn)大于花生油中的。Prestes等[22]研究表明脂肪酸不飽和度越高，油脂黏度越小，相應(yīng)弛豫時(shí)間越長，即飽和脂肪酸弛豫時(shí)間小于不飽和脂肪酸?？梢姡ㄉ团c摻偽植物油的脂肪酸組成及含量存在一定的差異，這也為低場(chǎng)核磁共振技術(shù)鑒別花生油摻偽提供了理論基礎(chǔ)。
表1 試驗(yàn)油脂的理化指標(biāo)
表2 不同植物油的脂肪酸組成
2.2 油脂CPMG回波衰減曲線分析
相同參數(shù)條件下對(duì)花生油及摻偽植物油的CPMG回波衰減曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，花生油與大豆油、玉米油的低場(chǎng)核磁回波衰減曲線存在一定的差異，其中花生油的回波曲線衰減速率最快，而大豆油和玉米油的回波曲線衰減速率相差不大，這可能與油脂內(nèi)部的碳鏈長度及飽和度不同有關(guān)。為了進(jìn)一步考察不同植物油CPMG回波衰減曲線的差異，本研究結(jié)合主成分分析對(duì)回波衰減曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。
通過主成分分析，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率超過99%，保留了CPMG回波衰減曲線原始數(shù)據(jù)大部分信息。由圖2可知，花生油與大豆油、玉米油在得分圖上可清楚區(qū)分，純花生油(對(duì)照組)分布于得分圖左側(cè)，所有摻偽植物油均分布于得分圖右側(cè)；大豆油與玉米油分布極為接近，甚至相互重疊。結(jié)合表2可以看出，花生油與摻偽植物油在得分圖中分布與其飽和程度有著密切關(guān)系，而且不同植物油的飽和程度是存在差異的。油脂不飽和度越高，碳鏈長度越長，氫質(zhì)子間的作用力越強(qiáng)，回波曲線衰減速率越慢[23]。因此基于CPMG回波衰減曲線信息結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別花生油的真?zhèn)问蔷哂锌尚行缘摹?/p>
2.3 聚類分析
花生油摻偽的種類較多，本研究以常見大豆油和玉米油為研究對(duì)象，通過CPMG回波衰減數(shù)據(jù)結(jié)合聚類分析對(duì)花生油真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別研究，設(shè)置聚類數(shù)為2，分別采用7種不同的聚類方法：K-means、K-medians、Hierarchical Single-linkage、Hierarchical Average-linkage、Hierarchical Complete-linkage、Hierarchical Median-linkage、Ward′s algorithm進(jìn)行分析，經(jīng)過比較選擇聚類方法Hierarchical Complete-linkage，樣品距離計(jì)算選用相對(duì)距離。首先，通過不同種類摻偽花生油樣本建立混合鑒別模型進(jìn)行分類；然后，再對(duì)每種類型摻偽花生油樣本分別建立單一模型，進(jìn)一步考察聚類分析的分類效果，結(jié)果見圖3、圖4和表3。
由圖3和表3可見，當(dāng)相對(duì)距離為3.8～10時(shí)，純大豆油、純玉米油及摻偽含量較高的摻偽花生油被歸為一類，而摻偽含量相對(duì)較低的摻偽花生油與純花生油被歸為另一類，該模型的正確識(shí)別率僅為18.9%，摻偽花生油僅有7.8%被識(shí)別，這表明聚類分析建立的混合鑒別模型無法正確識(shí)別花生油的真?zhèn)巍?/p>
如圖4和表3所示，單一模型能準(zhǔn)確識(shí)別純花生油和摻偽純植物油(純大豆油和純玉米油)，但對(duì)于摻偽花生油卻并不能完全鑒別；當(dāng)摻偽量為60%時(shí)，單一模型正確率為100%。雖然單一模型對(duì)摻偽花生油的識(shí)別能力要好于混合模型，但對(duì)于花生油摻入少量低廉油脂的辨別能力較差，其正確識(shí)別率小于50%。上述現(xiàn)象表明，利用聚類分析法僅能區(qū)分摻入大豆油(玉米油)不低于60%的油樣，對(duì)于純花生油和摻偽花生油不能完全區(qū)分。
表3 花生油摻偽聚類分析結(jié)果
2.4 支持向量機(jī)
2.4.1 參數(shù)優(yōu)選
SVM模型參數(shù)(正則化參數(shù)和核參數(shù))選取直接影響建模質(zhì)量及分類準(zhǔn)確程度。本研究采用網(wǎng)絡(luò)搜索法和粒子群算法相結(jié)合，確定正則化參數(shù)(C)和核參數(shù)(σ)的最優(yōu)組合。預(yù)設(shè)摻大豆油SVM模型中C和σ值的尋優(yōu)范圍分別為C∈rand[101，1015]，σ∈rand[10-14，101]；摻玉米油SVM模型中C和σ值的尋優(yōu)范圍分別為C∈rand[10-10，1010]，σ∈rand[10-10，1010]。根據(jù)交互驗(yàn)證準(zhǔn)確率來確定模型參數(shù)的最佳組合。由圖5可知，C和σ值過大或過小都會(huì)引起模型的過擬合或欠擬合現(xiàn)象，參數(shù)經(jīng)尋優(yōu)后，兩種摻偽鑒別模型的識(shí)別正確率均能達(dá)到100%，此時(shí)摻入大豆油和摻入玉米油的鑒別模型最佳參數(shù)組合分別為(2.2×1010, 1.0×10-4)和(2 154.4, 4.6×10-4)。
2.4.2 核函數(shù)選擇
SVM模型的核函數(shù)種類很多，如Linear、Polynomial、RBF和Sigmoid等，目前還沒有系統(tǒng)理論指導(dǎo)核函數(shù)的選擇，本研究分別采用不同核函數(shù)建立SVM模型，模型參數(shù)通過網(wǎng)絡(luò)搜索法結(jié)合粒子群算法進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果如表4所示。由表4可知，以核函數(shù)Linear和RBF所建的花生油摻偽模型的識(shí)別能力較強(qiáng)，而Sigmoid和Polynomial為核函數(shù)時(shí)模型的正確識(shí)別率相對(duì)較低，均為80.3%。模型中支持向量數(shù)(SVs)與核函數(shù)的類型無明顯關(guān)系。對(duì)于摻入大豆油的4種模型中SVs順序?yàn)镾igmoid < Linear < Polynomial < RBF，而在摻入玉米油的模型中，SVs順序則為RBF < Linear < Polynomial < Sigmoid。綜合考慮不同核函數(shù)的建模結(jié)果和支持向量數(shù)，并結(jié)合已有研究經(jīng)驗(yàn)，本研究選擇RBF作為SVM模型的核函數(shù)。
表4 不同核函數(shù)下SVM模型預(yù)測(cè)結(jié)果
2.4.3 模型的通用性與預(yù)測(cè)性
采用SVM法設(shè)計(jì)兩種鑒別模型：一種是對(duì)摻偽花生油全樣本建立的全局鑒別模型；另一種是對(duì)每種摻偽類型分別建立專一鑒別模型，即摻入大豆油模型和摻入玉米油模型。全局模型參數(shù)(C，σ)經(jīng)優(yōu)化后，其取值為(6.0×109，3.6×10-5)，此時(shí)支持向量數(shù)為84；專一模型優(yōu)化后參數(shù)如表5所示。
采用最優(yōu)的條件，分別建立花生油摻偽鑒別的全局模型和專一模型，通過盲樣考察模型的預(yù)測(cè)性能和通用性，結(jié)果如表5所示，全局模型和兩個(gè)專一模型對(duì)純花生油的預(yù)測(cè)識(shí)別率均為100%，與聚類分析相比，SVM模型不僅能夠準(zhǔn)確識(shí)別純花生油，而且當(dāng)樣品摻偽量較低(5%)時(shí)，也能夠準(zhǔn)確鑒別；全局模型的通用性要好于專一模型，特別是在未知摻偽油種類情況下全局模型優(yōu)勢(shì)更為顯著。此外，全局模型對(duì)于鑒別油脂種類也具有明顯優(yōu)勢(shì)(圖2)。綜上所述，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合支持向量機(jī)鑒別花生油和簡(jiǎn)單(二元)摻偽花生油是可行的。但是，鑒別模型本身也具有一定的局限性，就是對(duì)油脂等級(jí)(一級(jí)、二級(jí)等)或生產(chǎn)工藝(浸出法和壓榨法)變化較大的新樣品難以得到理想的預(yù)測(cè)結(jié)果，需要用新樣品對(duì)模型進(jìn)行及時(shí)更新和維護(hù)，進(jìn)一步擴(kuò)展模型的使用范圍。因此，下一步還需對(duì)低場(chǎng)核磁共振技術(shù)鑒別多元摻偽花生油進(jìn)行研究。
表5 不同模型的預(yù)測(cè)結(jié)果
3 結(jié)論
低場(chǎng)核磁共振技術(shù)是一種快速、無損、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，作者對(duì)花生油和摻偽植物油(大豆油和玉米油)的LF-NMR回波衰減曲線進(jìn)行了分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法探索區(qū)分油脂種類、快速鑒別花生油真?zhèn)蔚目尚行?。研究表明，基于CPMG回波衰減曲線信息可實(shí)現(xiàn)對(duì)花生油與非花生油種類的區(qū)分，支持向量機(jī)相比于聚類分析可更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)花生油真?zhèn)蔚蔫b別，該模型對(duì)摻偽花生油的正確識(shí)別率為100%，全局模型與專一模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性相差不大，但通用性要優(yōu)于專一模型。然而，摻偽油脂的種類復(fù)雜多變，為此需要建立更為豐富的摻偽植物油樣本庫，并及時(shí)更新相關(guān)模型。
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花生油以其氣味芳香、營養(yǎng)均衡而深受消費(fèi)者的喜愛。隨著花生油價(jià)格和需求量不斷升高[1]，市場(chǎng)上以假亂真現(xiàn)象頻頻發(fā)生，一些不法生產(chǎn)經(jīng)營者為牟取暴利，將劣質(zhì)油或低價(jià)油摻入花生油中，損害消費(fèi)者的健康和利益。
目前，國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 1534—2017《花生油》和GB/T 5539—2008《糧油檢驗(yàn) 油脂定性試驗(yàn)》)中未規(guī)定食用油真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法，僅規(guī)定了花生油感官評(píng)價(jià)(氣滋味、色澤、狀態(tài))、理化指標(biāo)(酸價(jià)、過氧化值、折射率等)的要求。實(shí)際檢測(cè)中，感官評(píng)價(jià)易受操作人員的影響，理化指標(biāo)測(cè)定費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、易接觸有毒溶劑，最大的問題是無法準(zhǔn)確鑒別油脂的真?zhèn)?。因此，開發(fā)一種新型、快速、環(huán)保的食用油摻偽檢測(cè)方法非常必要。
近年來，油脂摻偽檢測(cè)方法的研究主要集中于氣相色譜法[2]、近紅外光譜法[3]、紫外光譜法[4]、同位素法[5]、熒光光譜法[6]、拉曼光譜法[7]等。氣相色譜法靈敏度高，但分析過程復(fù)雜，包括多步樣品前處理及有機(jī)溶劑使用；近紅外光譜法具有快速、無損等優(yōu)點(diǎn)，但需要大量代表性樣品建模；紫外光譜法、熒光光譜法檢測(cè)成本低，但模型穩(wěn)定性較差；同位素法、拉曼光譜法儀器昂貴，技術(shù)還不夠成熟。低場(chǎng)核磁共振技術(shù)(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)作為一種新興便捷、低成本的檢測(cè)方法，具有快速、無損、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)，LF-NMR的CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)回波數(shù)據(jù)、縱向弛豫時(shí)間(T1)、橫向弛豫時(shí)間(T2)及擴(kuò)散系數(shù)等信息可以反映待測(cè)樣品內(nèi)部自旋核子種類及其所處的狀態(tài)，與樣品品質(zhì)有顯著的相關(guān)性[8]。油脂是脂肪酸甘三酯的混合物，脂肪酸占95%左右，不同油脂在脂肪酸種類和含量方面是有區(qū)別的。油脂中存在大量的氫質(zhì)子，其狀態(tài)及所處的物理化學(xué)環(huán)境不同，弛豫時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度亦有所不同。目前低場(chǎng)核磁共振技術(shù)在油脂檢測(cè)中的應(yīng)用主要為固體脂肪含量測(cè)定、煎炸油品質(zhì)判斷和極性組分定量檢測(cè)。徐愛軍等[9]考察了影響低場(chǎng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)固體脂肪含量的主要因素。王永巍等[10]研究了煎炸過程中低場(chǎng)核磁弛豫特性與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性。Wang等[11]、Sun等[12]通過低場(chǎng)核磁弛豫特性對(duì)油脂煎炸過程中極性組分進(jìn)行了定量檢測(cè)。Zhang等[13]、Lu等[14]利用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)識(shí)別合格植物油和煎炸老油。Hou等[15]、趙婷婷等[16]利用LF-NMR弛豫圖譜對(duì)不同植物油種類進(jìn)行了鑒別。周凝等[17]通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)研究米糠毛油摻偽，發(fā)現(xiàn)米糠毛油在10 ms處存在特征弛豫峰。然而，LF-NMR技術(shù)檢測(cè)油脂摻偽尚處于起步階段，特別是摻入低價(jià)植物油情況目前的研究較少。
基于此，本研究從單一種類和等級(jí)的摻偽花生油(大豆油、玉米油)入手，采用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(聚類分析、支持向量機(jī))對(duì)花生油真?zhèn)舞b別的可行性進(jìn)行研究，旨在為油脂真?zhèn)慰焖勹b別及其品質(zhì)分析提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
不同產(chǎn)地和批次的花生油(56種)、大豆油(5種)和玉米油(5種)均購于鄭州大型超市或生產(chǎn)廠家。正己烷(色譜純)、乙醚、異丙醇、甲醇鈉、冰乙酸、三氯甲烷、碘化鉀、酚酞、可溶性淀粉、無水硫酸鈉等，除特殊標(biāo)注外，均為分析純。
摻偽花生油樣品的配制：將植物油按5%、10%、15%、20%、30%、40%、60%和80%(以植物油質(zhì)量占油脂總質(zhì)量的百分比計(jì))摻入花生油中共配制400個(gè)摻假花生油樣品，對(duì)油樣進(jìn)行編號(hào)。以H2D3-5%為例，H2表示2號(hào)花生油，D3表示3號(hào)大豆油，5%表示5%的摻偽比例。對(duì)建模樣本按照3∶1隨機(jī)劃分為校正集和預(yù)測(cè)集樣本。
1.2 儀器設(shè)備
低場(chǎng)核磁共振分析儀：德國Bruker公司；XW-80A漩渦混合器：海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；SD制冷加熱循環(huán)水?。好绹鳳olyscience公司；BSA224 S分析天平：德國Sartorius公司；Agilent 8860氣相色譜儀：美國Agilent公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 理化指標(biāo)測(cè)定
酸價(jià)測(cè)定：參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；過氧化值測(cè)定：參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》。
1.3.2 脂肪酸組成分析
脂肪酸組成分析：油樣先甲酯化再進(jìn)入氣相色譜儀中測(cè)定，具體方法參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》。
氣相色譜條件：BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×25.0 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫170 ℃；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300 ℃；分流比20∶1；氮?dú)饬魉? mL/min；氫氣流速30 mL/min；空氣流速400 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。
1.3.3 低場(chǎng)核磁回波衰減曲線測(cè)定
準(zhǔn)確量取3 mL樣品移入核磁共振專用試管中，45 ℃水浴以保證樣品狀態(tài)一致性，然后置于樣品槽中進(jìn)行測(cè)定。利用低場(chǎng)核磁共振分析儀測(cè)定樣品的CPMG回波衰減曲線。儀器參數(shù)設(shè)置：采樣頻率200 kHz，重復(fù)采樣時(shí)間1 s，半回波時(shí)間0.5 ms，回波個(gè)數(shù)3 000個(gè)，重復(fù)掃描8次。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。
1.4 數(shù)據(jù)處理
利用主成分分析(PCA)對(duì)油樣的低場(chǎng)核磁回波衰減曲線數(shù)據(jù)降維，同時(shí)對(duì)花生油及摻偽花生油進(jìn)行判別，具體處理過程參見文獻(xiàn)[18]。采用聚類分析(CA)對(duì)花生油摻偽進(jìn)行定性分析，通過支持向量機(jī)(SVM)建立判別模型，并與CA法進(jìn)行比較。CA是一種無監(jiān)督的方法，其基本思想：每個(gè)樣本都自成為一類，規(guī)定類與類之間的距離，選擇距離最小的一對(duì)合并成為一類，依次類推，直至所有的樣本都聚為一類為止，然后再根據(jù)一定的原則如標(biāo)準(zhǔn)值或經(jīng)驗(yàn)，選取合適的分離閾值確定最終分類結(jié)果[19]。SVM是利用非線性函數(shù)將樣本映射到高維特征空間，根據(jù)結(jié)構(gòu)分析最小化原則，在高維特征空間中尋找最優(yōu)超平面，解決分類問題[20]。在SVM建模過程中，核函數(shù)及其參數(shù)選擇參照文獻(xiàn)[21]。以上數(shù)據(jù)處理均采用The Unscrambler X 10.4軟件完成，所得數(shù)據(jù)用Origin 2021b軟件進(jìn)行圖形繪制。
2 結(jié)果與討論
2.1 油脂理化指標(biāo)和脂肪酸組成分析
對(duì)花生油和摻偽植物油的理化指標(biāo)和脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1和表2。由表1可知，花生油和摻偽植物油的色澤和氣味均符合國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2716—2018)，其酸價(jià)和過氧化值均在國標(biāo)規(guī)定范圍內(nèi)。從表2脂肪酸組成上可以看出，花生油與其他摻偽植物油的主要脂肪酸基本一致，即棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亞油酸(18∶2)，其含量占總脂肪酸含量的90%以上，但受產(chǎn)地、氣候、加工工藝等因素影響，同種油脂的脂肪酸組成及含量存在一定的差異；花生油油酸含量較高屬于油酸型油脂，而大豆油和玉米油則屬于亞油酸型油脂；花生油中長碳鏈脂肪酸，如花生酸、山崳酸、木焦油酸等的含量明顯高于其他摻偽植物油，而亞麻酸并未檢出。花生油的單不飽和脂肪酸含量為46%～51%，明顯高于其他油脂；而大豆油和玉米油脂肪酸組成較為相似，多不飽和脂肪酸含量均大于53%，遠(yuǎn)大于花生油中的。Prestes等[22]研究表明脂肪酸不飽和度越高，油脂黏度越小，相應(yīng)弛豫時(shí)間越長，即飽和脂肪酸弛豫時(shí)間小于不飽和脂肪酸?？梢姡ㄉ团c摻偽植物油的脂肪酸組成及含量存在一定的差異，這也為低場(chǎng)核磁共振技術(shù)鑒別花生油摻偽提供了理論基礎(chǔ)。
表1 試驗(yàn)油脂的理化指標(biāo)
表2 不同植物油的脂肪酸組成
2.2 油脂CPMG回波衰減曲線分析
相同參數(shù)條件下對(duì)花生油及摻偽植物油的CPMG回波衰減曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，花生油與大豆油、玉米油的低場(chǎng)核磁回波衰減曲線存在一定的差異，其中花生油的回波曲線衰減速率最快，而大豆油和玉米油的回波曲線衰減速率相差不大，這可能與油脂內(nèi)部的碳鏈長度及飽和度不同有關(guān)。為了進(jìn)一步考察不同植物油CPMG回波衰減曲線的差異，本研究結(jié)合主成分分析對(duì)回波衰減曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。
通過主成分分析，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率超過99%，保留了CPMG回波衰減曲線原始數(shù)據(jù)大部分信息。由圖2可知，花生油與大豆油、玉米油在得分圖上可清楚區(qū)分，純花生油(對(duì)照組)分布于得分圖左側(cè)，所有摻偽植物油均分布于得分圖右側(cè)；大豆油與玉米油分布極為接近，甚至相互重疊。結(jié)合表2可以看出，花生油與摻偽植物油在得分圖中分布與其飽和程度有著密切關(guān)系，而且不同植物油的飽和程度是存在差異的。油脂不飽和度越高，碳鏈長度越長，氫質(zhì)子間的作用力越強(qiáng)，回波曲線衰減速率越慢[23]。因此基于CPMG回波衰減曲線信息結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別花生油的真?zhèn)问蔷哂锌尚行缘摹?/p>
2.3 聚類分析
花生油摻偽的種類較多，本研究以常見大豆油和玉米油為研究對(duì)象，通過CPMG回波衰減數(shù)據(jù)結(jié)合聚類分析對(duì)花生油真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別研究，設(shè)置聚類數(shù)為2，分別采用7種不同的聚類方法：K-means、K-medians、Hierarchical Single-linkage、Hierarchical Average-linkage、Hierarchical Complete-linkage、Hierarchical Median-linkage、Ward′s algorithm進(jìn)行分析，經(jīng)過比較選擇聚類方法Hierarchical Complete-linkage，樣品距離計(jì)算選用相對(duì)距離。首先，通過不同種類摻偽花生油樣本建立混合鑒別模型進(jìn)行分類；然后，再對(duì)每種類型摻偽花生油樣本分別建立單一模型，進(jìn)一步考察聚類分析的分類效果，結(jié)果見圖3、圖4和表3。
由圖3和表3可見，當(dāng)相對(duì)距離為3.8～10時(shí)，純大豆油、純玉米油及摻偽含量較高的摻偽花生油被歸為一類，而摻偽含量相對(duì)較低的摻偽花生油與純花生油被歸為另一類，該模型的正確識(shí)別率僅為18.9%，摻偽花生油僅有7.8%被識(shí)別，這表明聚類分析建立的混合鑒別模型無法正確識(shí)別花生油的真?zhèn)巍?/p>
如圖4和表3所示，單一模型能準(zhǔn)確識(shí)別純花生油和摻偽純植物油(純大豆油和純玉米油)，但對(duì)于摻偽花生油卻并不能完全鑒別；當(dāng)摻偽量為60%時(shí)，單一模型正確率為100%。雖然單一模型對(duì)摻偽花生油的識(shí)別能力要好于混合模型，但對(duì)于花生油摻入少量低廉油脂的辨別能力較差，其正確識(shí)別率小于50%。上述現(xiàn)象表明，利用聚類分析法僅能區(qū)分摻入大豆油(玉米油)不低于60%的油樣，對(duì)于純花生油和摻偽花生油不能完全區(qū)分。
表3 花生油摻偽聚類分析結(jié)果
2.4 支持向量機(jī)
2.4.1 參數(shù)優(yōu)選
SVM模型參數(shù)(正則化參數(shù)和核參數(shù))選取直接影響建模質(zhì)量及分類準(zhǔn)確程度。本研究采用網(wǎng)絡(luò)搜索法和粒子群算法相結(jié)合，確定正則化參數(shù)(C)和核參數(shù)(σ)的最優(yōu)組合。預(yù)設(shè)摻大豆油SVM模型中C和σ值的尋優(yōu)范圍分別為C∈rand[101，1015]，σ∈rand[10-14，101]；摻玉米油SVM模型中C和σ值的尋優(yōu)范圍分別為C∈rand[10-10，1010]，σ∈rand[10-10，1010]。根據(jù)交互驗(yàn)證準(zhǔn)確率來確定模型參數(shù)的最佳組合。由圖5可知，C和σ值過大或過小都會(huì)引起模型的過擬合或欠擬合現(xiàn)象，參數(shù)經(jīng)尋優(yōu)后，兩種摻偽鑒別模型的識(shí)別正確率均能達(dá)到100%，此時(shí)摻入大豆油和摻入玉米油的鑒別模型最佳參數(shù)組合分別為(2.2×1010, 1.0×10-4)和(2 154.4, 4.6×10-4)。
2.4.2 核函數(shù)選擇
SVM模型的核函數(shù)種類很多，如Linear、Polynomial、RBF和Sigmoid等，目前還沒有系統(tǒng)理論指導(dǎo)核函數(shù)的選擇，本研究分別采用不同核函數(shù)建立SVM模型，模型參數(shù)通過網(wǎng)絡(luò)搜索法結(jié)合粒子群算法進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果如表4所示。由表4可知，以核函數(shù)Linear和RBF所建的花生油摻偽模型的識(shí)別能力較強(qiáng)，而Sigmoid和Polynomial為核函數(shù)時(shí)模型的正確識(shí)別率相對(duì)較低，均為80.3%。模型中支持向量數(shù)(SVs)與核函數(shù)的類型無明顯關(guān)系。對(duì)于摻入大豆油的4種模型中SVs順序?yàn)镾igmoid < Linear < Polynomial < RBF，而在摻入玉米油的模型中，SVs順序則為RBF < Linear < Polynomial < Sigmoid。綜合考慮不同核函數(shù)的建模結(jié)果和支持向量數(shù)，并結(jié)合已有研究經(jīng)驗(yàn)，本研究選擇RBF作為SVM模型的核函數(shù)。
表4 不同核函數(shù)下SVM模型預(yù)測(cè)結(jié)果
2.4.3 模型的通用性與預(yù)測(cè)性
采用SVM法設(shè)計(jì)兩種鑒別模型：一種是對(duì)摻偽花生油全樣本建立的全局鑒別模型；另一種是對(duì)每種摻偽類型分別建立專一鑒別模型，即摻入大豆油模型和摻入玉米油模型。全局模型參數(shù)(C，σ)經(jīng)優(yōu)化后，其取值為(6.0×109，3.6×10-5)，此時(shí)支持向量數(shù)為84；專一模型優(yōu)化后參數(shù)如表5所示。
采用最優(yōu)的條件，分別建立花生油摻偽鑒別的全局模型和專一模型，通過盲樣考察模型的預(yù)測(cè)性能和通用性，結(jié)果如表5所示，全局模型和兩個(gè)專一模型對(duì)純花生油的預(yù)測(cè)識(shí)別率均為100%，與聚類分析相比，SVM模型不僅能夠準(zhǔn)確識(shí)別純花生油，而且當(dāng)樣品摻偽量較低(5%)時(shí)，也能夠準(zhǔn)確鑒別；全局模型的通用性要好于專一模型，特別是在未知摻偽油種類情況下全局模型優(yōu)勢(shì)更為顯著。此外，全局模型對(duì)于鑒別油脂種類也具有明顯優(yōu)勢(shì)(圖2)。綜上所述，低場(chǎng)核磁共振技術(shù)結(jié)合支持向量機(jī)鑒別花生油和簡(jiǎn)單(二元)摻偽花生油是可行的。但是，鑒別模型本身也具有一定的局限性，就是對(duì)油脂等級(jí)(一級(jí)、二級(jí)等)或生產(chǎn)工藝(浸出法和壓榨法)變化較大的新樣品難以得到理想的預(yù)測(cè)結(jié)果，需要用新樣品對(duì)模型進(jìn)行及時(shí)更新和維護(hù)，進(jìn)一步擴(kuò)展模型的使用范圍。因此，下一步還需對(duì)低場(chǎng)核磁共振技術(shù)鑒別多元摻偽花生油進(jìn)行研究。
表5 不同模型的預(yù)測(cè)結(jié)果
3 結(jié)論
低場(chǎng)核磁共振技術(shù)是一種快速、無損、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，作者對(duì)花生油和摻偽植物油(大豆油和玉米油)的LF-NMR回波衰減曲線進(jìn)行了分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法探索區(qū)分油脂種類、快速鑒別花生油真?zhèn)蔚目尚行?。研究表明，基于CPMG回波衰減曲線信息可實(shí)現(xiàn)對(duì)花生油與非花生油種類的區(qū)分，支持向量機(jī)相比于聚類分析可更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)花生油真?zhèn)蔚蔫b別，該模型對(duì)摻偽花生油的正確識(shí)別率為100%，全局模型與專一模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性相差不大，但通用性要優(yōu)于專一模型。然而，摻偽油脂的種類復(fù)雜多變，為此需要建立更為豐富的摻偽植物油樣本庫，并及時(shí)更新相關(guān)模型。
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