于小慧，丁 麗，劉 偉*，余晶晶*

1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001

油炸為食品原料提供了一個高溫加熱環(huán)境，在此條件下食品組分間發(fā)生一系列復雜的化學和物理變化，從而賦予油炸食品誘人的色澤和獨特的風味[1-2]，但同時也會產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)等有害物質[3]。隨著生活質量的提高，人們對優(yōu)質食品的需求不斷增加，消費者不僅僅關注食品的色、香、味，更關注食品的營養(yǎng)、質量和安全，因此食品行業(yè)關于AGEs的研究也逐漸開始受到學者的關注。

AGEs是還原糖和氨基化合物的游離氨基之間通過非酶反應產(chǎn)生的一系列復雜化合物[4]。研究表明當人體含有較高水平的AGEs，會增加糖尿病、動脈粥樣硬化、心血管疾病、腎病、衰老和阿爾茨海默病等多種慢性疾病發(fā)病的可能，而飲食是人體AGEs積累的重要來源[5-6]。Uribarri等[7]采用酶聯(lián)免疫法測定CML并建立了不同食品及其AGEs含量數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)高脂、高蛋白類食品中CML含量較高，高碳水化合物食品中CML含量較少。此外，雖然未經(jīng)加工的食物原料中也含有AGEs，但熱處理可顯著提高食品中AGEs的含量。食品中AGEs的形成途徑復雜多樣，美拉德反應是其主要形成途徑[3]：美拉德反應初期，還原糖與氨基化合物發(fā)生縮合反應生成席夫堿(Schiff base)，隨后席夫堿重排形成相對穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物；Amadori產(chǎn)物通過脫水、重排一系列反應進一步形成高反應活性的二羰基化合物，如3-脫氧葡萄糖醛酮(3-deoxyglucosone，3-DG)、乙二醛(Glyoxal，GO)、丙酮醛(methylglyoxal，MGO)等；最后，二羰基化合物與游離氨基反應生成結構穩(wěn)定的AGEs。此外，Amadori產(chǎn)物也可以通過有氧或無氧條件直接形成AGEs。除美拉德反應途徑外，脂質過氧化[8](Acetol 途徑)、還原糖自氧化[9](Wolff 途徑)以及席夫堿氧化裂解[10](Namiki途徑)也能生成二羰基化合物，從而進一步形成AGEs。羧甲基賴氨酸(Nε-(carboxymethyl)lysine，CML)和羧乙基賴氨酸(Nε-(carboxyethyl)lysine，CEL)是2種比較典型的AGEs，廣泛存在于各種加工食品中，因其含量豐富且存在穩(wěn)定，常被用做食品中AGEs的標記物[11-12]。

目前關于食品領域中AGEs的研究多集中于模擬體系中AGEs形成機制[13]、食品中AGEs含量的測定和調查[14-15]以及檢測方法[16-19]等方面，關于真實食品體系加工過程(如油炸、焙烤)中糖基化終產(chǎn)物的形成機制及影響因素的研究有待進一步完善[20]。因此，探明油炸條件對雞肉中AGEs形成的影響對掌握真實食品體系中AGEs的含量水平和指導膳食健康具有重要意義。

本研究采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術，以雞胸肉為原料，選擇不同的油炸條件對雞胸肉進行熱處理，分析油炸雞胸肉中CML和CEL含量變化情況，以期揭示油炸條件對AGEs形成的影響，為科學了解CML和CEL在油炸食品中的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冷凍雞胸肉、高油酸葵花籽油(一級，浸出)、大豆油(一級，浸出)、葵花籽油(一級，壓榨)、花生油(一級，壓榨)、玉米油(一級，壓榨)、菜籽油(三級，壓榨)、棕櫚油(一級，凝固點23 ℃)均購于鄭州當?shù)爻小?/p>

1.2 主要試劑

CML、CEL、CML-d4和CEL-d4標準品：加拿大Toronto Research Chemicals公司；乙腈、甲醇和正己烷：HPLC級，美國Dikama公司；醋酸：HPLC級，美國Tedia公司；鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硼氫化鈉：分析純，國藥化學試劑北京有限公司；氨水：分析純，德國CNW科技公司；其他試劑均為分析純。CML、CEL、CML-d4、CEL-d4各0.1 mg/mL原液用純水制備，0 ℃冰箱保存。

1.3 儀器與設備

Fd-1A-50冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；WeighMax電炸鍋:湖北香江電器股份有限公司；TGL-16 M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；氮氣吹氣濃縮儀:美國Caliper lifesciences Turbovap II公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱:河南泰斯特儀器有限公司；多管渦旋器:德國Talboys公司；Agilent 1200高效液相色譜儀:美國Agilent公司；Triple Quad 4000質譜儀:美國AB Sciex公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

選取清洗干凈、去除表面脂肪和筋膜的雞胸肉若干，用絞肉機絞碎，稱取(10.0±0.2)g肉糜，于直徑3 cm、高1 cm模具內(nèi)制成的肉餅，備用。

1.4.2 油炸試驗

將1.0 L的植物油加入恒溫油炸鍋中，當油溫升到預設溫度時，將制備好的雞胸肉油炸一定時間，油炸過程中用溫度計實時監(jiān)測溫度變化情況。油炸結束，將油炸雞肉瀝去多余油脂，冷卻至室溫后置于密封袋中于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 雞肉基本組分的測定

雞肉中水分、脂肪、蛋白質、灰分含量的測定分別參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》、GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》、GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》、GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。

1.4.4 樣品中CML 和 CEL 含量的測定

參照Yu等[21]的方法并稍做修改。準確稱取40 mg粉碎后的樣品于50 mL離心管中，用6 mL正己烷脫脂，重復3次。樣品脫脂后用氮氣吹干，轉移到水解管中。加入1.5 mL硼酸鈉溶液(0.2 mol/L, pH 9.2)和1～3滴1-辛醇，再逐滴加入1 mL硼氫化鈉，4 ℃靜置過夜。然后加入2.6 mL 12 mol/L HCl，抽真空通氮氣置換3次后密封，將樣品在110 ℃下水解24 h。水解后的溶液過濾，濾液加水定容至10 mL。然后取1 mL濾液，加入1 mL水和100 μL內(nèi)標，混勻后過陽離子交換固相萃取柱。陽離子交換固相萃取柱依次用2 mL甲醇和0.1 mol/L鹽酸溶液活化后上樣，再用2 mL水洗滌，最后用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮氣吹干，1 mL水復溶，過0.22 μm水相濾膜，濾液置于色譜瓶中，進行HPLC-MS/MS分析。

液相色譜條件如下。儀器為Agilent 1200；色譜柱: Agilent Proshell 120 SB C18柱(3.0 mm×150 mm, 2.7 μm)；柱溫35 ℃；流速 0.3 mL/min；進樣量 10 μL；流動相 A 為 0.3%乙酸水溶液，B 為 0.3%醋酸-乙腈溶液，梯度洗脫條件：0～5.0 min，100% A～80% A；5.1～10.0 min，80% A～10% A；10.1～15 min，100% A。

質譜條件如下。電離方式：正離子模式(ESI+)；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)，參數(shù)如表1所示；離子噴霧電壓5.0 kV；離子源溫度550 ℃；氣簾氣氮氣，30 psi；霧化氣70 psi，輔助氣，70 psi。

表1 HPLC-MS 多反應監(jiān)測模式(MRM)參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進行3次重復，數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示；SPSS 19軟件進行統(tǒng)計分析；Analyst Software 用于AGEs數(shù)據(jù)分析；Origin 2021用于繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 原料基本組分及CML和CEL含量

雞胸肉的基本組分含量如表2所示，水分含量為72.43%，蛋白含量為21.78%，脂肪含量為2.36%，灰分含量為1.52%。為了解油炸對雞胸肉中AGEs含量的影響，對原料雞胸肉中CML、CEL含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)加工的雞胸肉中CML、CEL含量分別為(144.50±14.14)mg/kg、(9.38±0.14)mg/kg，AGEs含量較低。Zhu等[22]在未經(jīng)煎炸的雞胸肉中也檢測到較低含量的CML和CEL。這可能是因為在高蛋白、高脂肪的肉類體系中，美拉德反應和脂質氧化在常溫條件下緩慢進行，從而導致生肉中能夠積累少量的AGEs。

表2 原料基本組分及CML和CEL含量

2.2 植物油種類對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響

在油炸溫度為180 ℃、油炸時間為5 min條件下，研究了大豆油、花生油、玉米油、葵花籽油、高油酸葵花籽油、棕櫚油、菜籽油7種植物油脂對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響。由圖1可以看出，經(jīng)不同種類的油脂在180 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML含量為218.40～311.20 mg/kg，CEL含量為43.38～64.00 mg/kg，油炸加工顯著增加了雞胸肉中CML和CEL含量。不同種類的植物油脂油炸雞胸肉中CML存在較大差異，采用不同油脂油炸的雞胸肉中CML含量的由高到低：大豆油>花生油>玉米油≈葵花籽油>棕櫚油>菜籽油>高油酸葵花籽油，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中CML含量較低，分別為218.40、226.40 mg/kg，顯著低于其他5種油脂(P<0.05)。對于CEL而言，棕櫚油油炸雞胸肉中CEL含量較高，為64.00 mg/kg，但整體而言，不同植物油油炸雞胸肉中CEL含量差異不明顯(P>0.05)。高油酸葵花籽油油酸含量大約為85%，多不飽和脂肪酸含量相對較低，較傳統(tǒng)植物油而言具有較高的氧化穩(wěn)定性；菜籽油為三級成品油，可能含有較高含量的天然抗氧化物質，在熱加工過程中可以在一定程度上抑制脂質氧化。脂質氧化是形成AGEs中間物質的一個重要途徑，因此高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中AGEs含量較低的原因可能是，二者在熱加工過程中脂質氧化程度較其他幾種植物油低。由此可見，在油炸食品過程中選用合適的油脂對控制食品中的AGEs具有重要意義。大豆油作為一種大宗油料，價格較低，在我國食用油中年消費量最大[23]，日常生活中使用廣泛，因此選用大豆油作為煎炸油進行后續(xù)研究。

2.3 油炸溫度對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響

溫度是影響糖基化終產(chǎn)物形成的一個關鍵因素。以大豆油炸雞胸肉，設定油炸時間為5 min，研究不同溫度對油炸雞胸肉中CML和CEL含量的影響。由圖2可以看出，在140～220 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加CML、CEL含量不斷增加，溫度越高，樣品中CML、CEL含量越高、生成速率越快。在220 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML、CEL的生成速率分別為34.62、49.47 mg/kg·min-1，分別為140 ℃條件下的2.53倍、19.02倍；在140～180 ℃范圍內(nèi)，CML的增長速率顯著高于CEL，而在180～200 ℃之間，CML增長緩慢，CEL含量急劇增長，CML和CEL的含量增長速率存在顯著差異，這可能是與CML和CEL的生成途徑不同有關。吳帥[24]研究了雞蛋蛋白在熱加工過程中CML和CEL的生成規(guī)律，發(fā)現(xiàn)二者生成的活化能分別為100.89 kJ/mol和122.39 kJ/mol，表明CEL比CML較難生成，因此較低溫度(140～180 ℃)條件下CEL的生成速率要小于CML。因此，在140～220 ℃油炸溫度范圍內(nèi)，溫度越高，油炸雞胸肉中CML和CEL含量越高，油炸時在保證食物營養(yǎng)、風味、色澤和生產(chǎn)效率的同時，要盡可能選擇較低的油炸溫度。

2.4 油炸時間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

在180 ℃條件下，采用大豆油對雞胸肉進行油炸，研究不同油炸時間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響，結果如圖3所示。在相同溫度條件下，0～11 min隨著油炸時間的延長，雞胸肉中CML和CEL含量不斷增加。其中CML含量從初始含量144.50 mg/kg增長至347.50 mg/kg，約為生肉中的2.40倍；CEL從9.38 mg/kg增加到93.25 mg/kg，增加了8.94倍；油炸時間越長，雞胸肉中CML和CEL 含量水平越高。0～3 min食品體系內(nèi)反應底物充足，CML、CEL快速大量積累；繼續(xù)延長油炸時間，食品中反應底物逐漸被消耗，導致CML和CEL含量增長速率有所下降。在180 ℃油炸條件下，相較于CEL，雞胸肉中CML更容易在較短時間內(nèi)得到大量積累。油炸時間為7、9、11 min時，油炸雞胸肉中CML含量分別為332.50、336.38、347.50 mg/kg，較為相近。由此可見，在一定范圍內(nèi)油炸時間對雞胸肉中CML含量影響并不顯著，可以采取在較低溫度條件下通過適當延長油炸時間保障食品風味及色澤的同時降低AGEs含量。

2.5 油炸次數(shù)對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

通常在制作油炸食品時，植物油會反復加熱使用。Chhabra等[25]曾報道，經(jīng)多次重復加熱使用的油脂其油炸樣品中熒光性AGEs含量要高于新鮮油脂的油炸樣品。如圖4所示，在180 ℃、5 min油炸條件下，研究了大豆油的油炸次數(shù)對雞胸肉中CML和CEL含量的影響?？傮w而言，隨著大豆油反復使用次數(shù)的增加，CEL含量變化不明顯，CML含量有所下降。這可能是因為隨著油脂不斷進行加熱和反復油炸食物時，油脂發(fā)生氧化降解，生成的中間體物質GO、MGO進入食物體系內(nèi)參與CML和CEL的形成而不斷被消耗，導致食品體系內(nèi)參與CML和CEL反應的GO、MGO含量下降，從而導致其含量降低。此外，油炸次數(shù)相近的雞胸肉樣品中，CML、CEL含量相差不大，表明在相對較短時間內(nèi)油脂重復使用并不足以引起AGEs含量發(fā)生顯著變化。

2.6 油脂連續(xù)加熱時間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響

為進一步了解油脂在油炸過程中對雞胸肉中AGEs含量的影響，選用大豆油，在180 ℃、5 min的油炸條件下，研究了油脂連續(xù)加熱時間對雞胸肉中CML和CEL含量的影響。將油溫升至180 ℃的時間點記為0 h，在0～12 h內(nèi)取點對雞胸肉進行油炸，雞胸肉中CML、CEL含量變化情況如圖5所示。0 h時，油炸雞胸肉中CML含量為325.00 mg/kg，CEL含量為51.63 mg/kg；當大豆油在180 ℃條件下連續(xù)加熱12 h后，樣品中CML含量為252.50 mg/kg，CEL含量為39.125 mg/kg；隨著油脂連續(xù)加熱時間的延長，雞胸肉中CML和CEL含量有所下降。這可能是因為油脂連續(xù)加熱過程前期，進入到食品體系的油脂在高溫條件下氧化形成CML和CEL的中間體物質GO和MGO，參與并促進了CML和CEL的形成。當油脂在較高溫度下加熱較長時間后，一方面中間體物質GO、MGO不斷被消耗，導致參與形成CML和CEL的量降低；另一方面油脂在高溫條件下發(fā)生氧化和水解反應，產(chǎn)生游離脂肪酸和部分小分子酸性物質，而Kong等[26]的研究表明酸性增強可延緩體系中AGEs的形成。所以隨著油脂連續(xù)加熱時間的不斷延長，油炸雞胸肉中CML和CEL含量有所下降。

3 結論

研究了不同油炸條件對雞胸肉中CML和CEL含量的影響，結果表明：生肉中CML和CEL的含量分別為144.50 mg/kg和9.38 mg/kg，采用不同植物油在180 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML含量為218.40～311.20 mg/kg，CEL含量為43.38～64.00 mg/kg，油炸加工顯著增加了雞胸肉中CML和CEL含量。不同種類的植物油脂油炸雞胸肉中CML存在較大差異，高油酸葵花籽油和菜籽油油炸雞胸肉中CML含量較低，分別為218.40、226.40 mg/kg，顯著低于其他5種油脂，對于CEL而言，油脂種類對其含量的影響不明顯；CML和CEL含量隨油炸溫度的升高和油炸時間的延長呈不斷增加趨勢，溫度越高，CML和CEL的生成速率越快，在220 ℃條件下油炸5 min的雞胸肉中CML和CEL的生成速率分別為34.62、49.47 mg/kg·min-1，分別為140 ℃條件下油炸雞胸肉的2.53倍和19.02倍；隨油炸次數(shù)的增加，CML含量略有下降，CEL含量整體變化不明顯；隨油脂連續(xù)加熱時間的延長，油炸雞胸肉中CML和CEL的含量略有下降，CML和CEL的含量均在初始時間油炸時取得最大值，分別為325.00、51.63 mg/kg。因此，在對食品進行油炸加工時，可以通過優(yōu)化油炸條件調控油炸食品中AGEs的含量，本研究對指導油炸食品中風險因子的防控有一定參考意義。