王靜， 康媛潔， 劉翠翠， 石曉嵐， 馬彩玲

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)簡稱為哮喘，是一種以氣道炎癥、氣道高反應性、黏液高分泌、黏液水腫和氣道重塑為主要特征的異質(zhì)性炎癥性疾病，是最常見的慢性呼吸道疾病之一[1]。支氣管上皮細胞(bronchial epithelial cells, EBCs)作為呼吸道防御的第一道防線，可通過合成和釋放細胞因子及趨化因子等維持氣道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[2]。近年來的研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，EBCs的損害、脫落能夠?qū)е職獾姥装Y和氣道重塑，而改善EBCs損傷被認為是治療BA和其他高反應性氣道疾病的重要策略。脂多糖(lipo polysaccharides, LPS)是構(gòu)成革蘭氏陰性細菌細胞壁的重要成員，有誘導機體炎癥反應的作用，常被作為EBCs損傷體外研究的刺激源[5-6]。G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型(G protein coupled receptor family C group 5 member A, GPRC5A)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，在調(diào)節(jié)小鼠肺損傷過程中發(fā)揮重要作用[7]。文獻[8]報道，以GPRC5A為靶標的藥物Tretinoin對BA有一定的治療作用，但GPRC5A在BA中的具體功能機制尚未明確。筆者擬通過研究LPS刺激下EBCs中GPRC5A的表達和GPRC5A過表達后對EBCs的細胞活力、細胞凋亡、炎癥反應及氣道黏蛋白分泌的影響，探討GPRC5A對BA的影響和可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2018年2月—2020年1月西安市兒童醫(yī)院呼吸哮喘中心招募的42組重度BA患者，年齡(41.02±8.14)歲(29～58歲)，男性17例，女性25例。選取同期28組健康受試者作為對照組，年齡(39.71±9.40)歲(27～61歲)，男性15例，女性13例。參與者未接受全身類固醇或者激素治療。根據(jù)GINA指南[9]，BA診斷基于反復發(fā)作的喘息、呼吸困難、咳嗽和痰液產(chǎn)生等。本研究通過西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(倫理號20220065)，參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 材料 正常人EBCs株16HBE(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；LPS(E.coliO55:B5)、MTT 試劑和脂質(zhì)體2000(美國Sigma公司)；胰蛋白酶、DMSO、青霉素-鏈霉素溶液和PCR引物(中國上海生工生物公司)；pcDNA3.1載體質(zhì)粒、Lipofectamine 3000試劑(美國Invitrogen公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、裂解液和凋亡檢測試劑盒(中國上海碧云天生物公司)；RNeasy mini試劑盒(德國Qiagen公司)；GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；SYBR R Premix Ex TaqTM試劑(日本TaKaRa公司)；PVDF 膜和發(fā)光顯影液(美國Millipore公司)；NF-κB p65抗體(1∶800, GTX00947, 美國Gene Tex公司)；κB抑制因子抗體(inhibitory kappa B alpha, IκBα)(1∶1 000, A1187, 美國ABclonal公司)；GPRC5A抗體(1∶1 000, ab155557)；Bax抗體(1∶500, ab53154)；Bcl-2抗體(1∶500, ab196495)；Cleaved caspase-3(1∶1 000, ab2302)；GAPDH 抗體(1∶1 000, ab9485)和辣根過氧化酶標記的二抗(1∶10 000, ab205718)(均為美國Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分析 從基因表達組學數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得轉(zhuǎn)錄組基因芯片的數(shù)據(jù)集GSE64913。該數(shù)據(jù)集共進行17位重度BA患者和23位健康受試者外周氣道上皮組織的收集和基因表達分析。

1.3.2 組織樣本獲取及分析 通過支氣管上皮刷分別采集重度BA患者和對照組的氣道上皮組織，-80 ℃下凍存。

1.3.3 EBCs損傷模型的建立及分組 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)EBCs株16HBE，置于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，于細胞匯合至70%～80%時傳代。首先進行LPS誘導EBCs損傷模型的劑量及時間梯度試驗，以不同質(zhì)量濃度的LPS(10、25、50、100 mg/mL)刺激狀態(tài)良好的16HBE細胞，處理不同時間(6、12、24、48 h)，MTT法測定細胞活力以確定用于進一步實驗的最佳非細胞毒性劑量及處理時間。將細胞分為4組，每組3個復孔：Control組(未處理)、LPS 組(50 mg/L LPS處理24 h)、LPS+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后經(jīng)50 mg/L LPS處理24 h)和LPS+pcDNA-GPRC5A組(轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A后經(jīng)50 mg/L LPS處理24 h)。其中pcDNA為pcDNA3.1質(zhì)粒，作為空白載體對照；pcDNA-GPRC5A過表達質(zhì)粒是將人源GPRC5A基因插入pcDNA3.1載體中構(gòu)建而成。使用Lipofectamine 3000試劑進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)實驗的檢測。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測GPRC5A、IL-6和TNF-α mRNA的表達 利用RNeasy mini試劑盒從細胞裂解液中提取總RNA，采用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得cDNA。根據(jù)SYBR R Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行PCR定量檢測，利用GAPDH為內(nèi)參。使用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western-blot法檢測GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、NF-κB p65、IκBα的蛋白表達 將處理結(jié)束后的16HBE細胞裂解于含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液，于冰上裂解10 min，4 ℃×12 000 r/min離心30 min，上清液即為總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測獲得的總蛋白濃度后，利用SDS-PAGE凝膠進行電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂乳Tris緩沖液進行封閉2 h，分別加入兔抗 GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、IκBα、NF-κB p65、GAPDH，4 ℃過夜，再加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育2 h，利用ECL發(fā)光液進行顯影，蛋白條帶灰度值由Image J軟件進行定量。

1.3.6 MTT檢測16HBE細胞活力 收集處理后的16HBE細胞，以適當密度接種至96孔細胞板上。每組設5個平行孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，添加20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的MTT溶液。孵育4 h后，加入DMSO溶液震蕩反應至結(jié)晶溶解。采用酶標儀在λ=490 nm處檢測16HBE細胞的吸光度(optical density, OD)，其變化趨勢與細胞活力變化一致，可以表征細胞活力[10]。

1.3.7 流式細胞術檢測16HBE細胞的凋亡 收集處理結(jié)束后的16HBE細胞，用500 μL的binding buffer懸浮細胞，加入5 μL的annexin V FITC避光反應20 min，加入5 μL的PI避光反應20 min，用0.048 mm銅篩過濾，1 h內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每個樣品做3次平行實驗，實驗重復2次。

2 結(jié) 果

2.1 GPRC5A在LPS活化的16HBE細胞和氣道上皮組織中表達 BA患者組織中GPRC5 mRNA的表達水平高于對照組(P<0.05，圖1A)。在氣道上皮組織的樣本數(shù)據(jù)集GSE64913中，患有嚴重BA的人群中GPRC5A mRNA的表達量低于對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B)。與Control組細胞比較，LPS處理呈劑量和時間依賴性降低16HBE細胞活力，其中50 mg/mL的LPS處理16HBE細胞24 h可使細胞活力下降約50%(P<0.05，圖1C～D)，因此，該處理條件下的細胞可作為后續(xù)實驗的體外BA模型。通過qRT-PCR和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，LPS處理組的GPRC5A mRNA和蛋白的表達量均降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1E～F)。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；BA：支氣管哮喘；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；LPS：脂多糖。A、B圖中G1組：重度BA氣道上皮組織(n=42)；G2組：健康受試氣道上皮組織(n=28)。與G2組比較，#：P<0.05。C圖中Control組：未處理的16HBE細胞；不同濃度LPS(10、25、50、100 mg/mL)處理的16HBE細胞。與Control組比較，#：P<0.05；與25 mg/mL LPS組比較，$：P<0.05；與50 mg/mL LPS組比較，&：P<0.05。D圖中Control組：未處理的16HBE細胞；50 mg/mL LPS處理16HBE細胞不同時間(6、12、24、48 h)。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS 6 h處理組比較，$：P<0.05；與LPS 24 h處理比較，&：P<0.05。E、F圖Control組：未處理的16HBE細胞；LPS組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細胞；與Control組比較，#：P<0.05。圖1 GPRC5A在LPS活化的16HBE細胞和氣道上皮組織中的表達Fig.1 Expression of GPRC5A in LPS-induced 16HBE cells and airway epithelial tissues

2.2 GPRC5A 促進16HBE細胞活力并抑制凋亡 qRT-PCR和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Control組及對照組比較，pcDNA-GPRC5A轉(zhuǎn)染組中GPRC5A的mRNA和蛋白表達水平提高，且差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2A～B)。與Control組比較，LPS處理組的細胞活力降低，而細胞凋亡率顯著升高，Bax和Caspase-3蛋白表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著下降，且差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2C～F)。此外，與LPS處理組比較，pcDNA-GPRC5A轉(zhuǎn)染組的細胞活力升高，細胞凋亡率降低，Bax和Caspase-3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，且差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；LPS：脂多糖。A～F圖中Control組：未處理的16HBE細胞；pcDNA組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細胞；pcDNA-GPRC5A組：轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細胞；LPS+pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖2 GPRC5A過表達對LPS活化的16HBE細胞活力與凋亡的影響Fig.2 Effects of GPRC5A overexpression on cell viability and apoptosis in LPS-induced 16HBE cells

2.3 GPRC5A抑制LPS活化的炎癥因子、氣道黏蛋白的表達 LPS處理組的TNF-α與IL-6 mRNA表達水平高于Control組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而LPS處理組在過表達GPRC5A后，TNF-α 與IL-6 mRNA表達水平降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A～B)。LPS處理組的氣道黏蛋白MUC5AC蛋白表達量高于Control組，在過表達GPRC5A后，MUC5AC蛋白表達量又下降，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3C～D)。

2.4 GPRC5A抑制LPS活化的NF-κB信號通路相關蛋白的表達 Western-blot檢測結(jié)果可見，與Control組比較，LPS處理組NF-κB信號通路相關蛋白IκBα與NF-κB p65的蛋白表達水平升高，且差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LPS處理組在轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A后，IκBα與NF-κB p65的蛋白表達水平降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；LPS：脂多糖；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；IL-6：白細胞介素-6；MUC5AC：黏蛋白5AC；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。Control組：未處理的16HBE細胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細胞；LPS+pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h 后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖3 GPRC5A過表達對LPS活化的16HBE細胞炎癥和氣道黏蛋白MUC5AC表達的影響Fig.3 Effects of GPRC5A overexpression on inflammation and MUC5AC expression in LPS-induced 16HBE cells

LPS：脂多糖；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；IκBα：人核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α；NF-κB p65：NF-κB的一個亞基，由p65-RelA和RelB組成；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型。Control組：未處理的16HBE細胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細胞；LPS + pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖4 GPRC5A過表達對LPS活化的16HBE細胞NF-κB通路相關蛋白IκBα與NF-κB p65表達的影響Fig.4 Effects of GPRC5A overexpression on the expression of NF-κB pathway related proteins IκBα and NF-κB p65 in LPS-induced 16HBE cells

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體是一類含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域的受體，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，多以二聚體的形式與胞內(nèi)G蛋白相互結(jié)合來傳遞信號，參與調(diào)節(jié)細胞的重要生理活動[11]。GPRC5A是G蛋白偶聯(lián)受體家族的一個成員，最初是在人類口腔鱗癌細胞株UMSCC-22B 中發(fā)現(xiàn)，可被維甲酸(retinoic acid，RA)誘導和調(diào)節(jié)，因此，又稱為RA誘導基因1(retinoic acid inducible gene 1,RAIG1)[12]，其主要在支氣管肺泡上皮中表達，對于肺穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有重要意義。近年來研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，與GPRC5A在小鼠和人肺組織中的特異性表達比較，其在肺癌組織中的表達水平顯著下調(diào)，并且GPRC5A敲除小鼠在 1～2 a中會自發(fā)肺癌，表明GPRC5A可能是一種肺癌抑癌基因。進一步的研究[15]報道，在接受LPS刺激后，GPRC5A敲除小鼠肺組織中產(chǎn)生的炎癥因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠，由此說明GPRC5A敲除使小鼠肺組織對LPS刺激更敏感。本研究結(jié)果表明，在成功構(gòu)建的LPS誘導的16HBE EBCs損傷模型中，GPRC5A的表達明顯降低，提示GPRC5A可能參與調(diào)控BA的進展。

值得注意的是，LPS可與白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)/Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)/骨髓分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2, MD2)復合物模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)結(jié)合，調(diào)節(jié)IκBα的穩(wěn)定性進而影響NF-κB的轉(zhuǎn)位及炎性因子的釋放[16-17]。GPRC5A基因敲除通過激活在小鼠肺上皮細胞中的NF-κB信號通路，從而促進了肺部炎癥和腫瘤發(fā)生，而抑制NF-κB信號通路能夠逆轉(zhuǎn)上述改變，提示GPRC5A基因在疾病中的作用與NF-κB信號通路有關[7,18]。NF-κB信號通路通過調(diào)節(jié)一些細胞因子的表達，參與細胞的炎癥反應、腫瘤發(fā)生、免疫反應、細胞凋亡等多種生物學進程[19]。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，在BA患者痰液中的嗜酸性粒細胞、EBCs、肺泡巨噬細胞等細胞中均存在NF-κB信號通路的激活現(xiàn)象，并且NF-κB調(diào)控的炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)、趨化因子與黏附因子(ICAM-1、VCAM-1)及炎性類酶(iNOS, COX-2)等均在BA疾病發(fā)生過程中起著主要作用[16,19-22]。此外，氣道黏蛋白MUC5AC能促進炎癥細胞浸潤誘導BA的發(fā)生[23]。有趣的是，在體內(nèi)外的研究[22, 24-25]中均發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB信號通路的激活，可以調(diào)節(jié)EBCs中炎癥因子和MUC5AC的分泌，并對細胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在16HBE細胞中，過表達GPRC5A可通過下調(diào)NF-κB信號通路相關蛋白(IκBα與NF-κB p65)的表達，抑制LPS誘導的炎癥因子TNF-α、IL-6以及氣道黏蛋白MUC5AC分泌，進而促進細胞活力，抑制細胞凋亡。由此可見，GPRC5A過表達對LPS誘導的16HBE細胞損傷有調(diào)控作用。

綜上所述，本研究闡明了GPRC5A在EBCs損傷的炎癥反應和凋亡中的作用，并發(fā)現(xiàn)其機制與NF-κB信號通路有關，為GPRC5A在BA中的功能研究及機制探索提供了理論基礎，同時為BA疾病的治療中提供潛在靶點。后續(xù)研究中應進一步分析GPRC5A對BA病理進展中的氣道高反應性、氣道重塑及黏液栓形成的影響；從動物水平驗證GPRC5A在BA發(fā)生、發(fā)展中的作用。