郭夢橋 陳軒宇 洪森榮 李 嬌 樊 潔 程薪宇

（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒 334001）

三葉青（Diels &Gilg），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、金線吊葫蘆等，為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（），多年生草質(zhì)藤本植物，全草或塊根入藥，具有抗腫瘤、消炎、調(diào)節(jié)免疫等功效。由于三葉青的抗癌作用與其黃酮類成分有關(guān)，因而目前對三葉青的研究主要側(cè)重于其黃酮類化合物的分離鑒定及藥理作用等方面的研究，總黃酮含量亦成為衡量三葉青種質(zhì)資源（簡稱“資源”）品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。而對于三葉青種質(zhì)資源多樣性及品質(zhì)比較的研究，則主要研究內(nèi)容涉及分子標(biāo)記、同工酶、色譜分析及農(nóng)藝性狀的比較分析等方面，例如朱波等發(fā)現(xiàn)不同三葉青資源的葉與根系農(nóng)藝性狀均存在顯著差異，可作為三葉青種源地初步鑒定的判斷依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，部分研究人員還發(fā)現(xiàn)三葉青種源地地理位置、生境與總黃酮含量存在一定相關(guān)性，如吉慶勇等發(fā)現(xiàn)麗水市不同海拔三葉青總黃酮含量隨海拔升高呈先增高后降低的趨勢。但此類研究涉及區(qū)域多相對較小，或僅以根部或葉長、葉寬等少量葉形性狀為依據(jù)對少數(shù)幾個資源進行比較和鑒別，而僅憑這些性狀卻不能滿足對大量資源同時進行比較和鑒別的需要，且以根部性狀為鑒別依據(jù)，會對植株造成嚴(yán)重損傷，不利于資源的保存，甚至可能影響育種速度?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，同一作物不同資源間，葉形常存在較大差異，可作為資源鑒別依據(jù)，而不同資源間的葉形差異有時亦可在一定程度上反應(yīng)資源間總黃酮含量上的差異。而對于三葉青資源間豐富多樣的葉形變化而言，何種葉形性狀更適于作為資源間鑒別依據(jù)，以及葉形性狀對三葉青地上部分總黃酮含量是否具有指示作用，目前均無相關(guān)報道出現(xiàn)。鑒于此，本研究以引自我國12 個?。ㄖ陛犑校┑?9份三葉青資源為材料，對各資源葉表型性狀進行統(tǒng)計比較，并與各資源地上部分總黃酮含量進行相關(guān)性分析，意在揭示三葉青葉表型性狀間的聯(lián)系，確定葉表型性狀在三葉青種質(zhì)資源鑒別中的價值，以及其與種源地位置和總黃酮含量間的關(guān)系，為快速培育高黃酮含量的優(yōu)質(zhì)三葉青品種提供更為直觀的形態(tài)學(xué)判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

為確保三葉青各資源葉形特征為其自身固有性狀，而非受不同生長環(huán)境短期影響所致，本研究以2020 年10 月29 日采集于上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司懷玉山三葉青引種園的49份三葉青種質(zhì)資源地上部分為研究材料（所有資源均已于采集地栽種3年以上），各資源種源地信息見表1。

表1 三葉青種源地信息Table 1 The provenance information of T.hemsleyanum

1.2 研究方法

選擇各資源長勢旺盛植株，每株取5片遠離莖末端的完全伸展葉，測量葉柄長、中葉長等12個葉表型長度性狀（簡稱“長度性狀”），并在此基礎(chǔ)上，換算得到葉柄比等7 個葉表型比例性狀（簡稱“比例性狀”），取平均值，各資源設(shè)置6次重復(fù)，測量結(jié)果如表2所示。

取各資源地上部分鮮樣（含莖、葉），50 ℃烘干至恒重（約72 h 以上），再將烘干所得干樣粉碎后過100 目篩，作為總黃酮檢測樣品?？傸S酮含量（total flavonoids content，TFC）檢測方法參考馬祥等，各資源重復(fù)測定3次。

利用SPSS 20.0 對三葉青葉長度性狀、比例性狀和種源地位置進行相關(guān)性分析，并提取葉長度性狀公因子，利用公因子得分進行聚類分析以及三葉青葉表型性狀和地上部分總黃酮含量的相關(guān)性分析。

2 研究結(jié)果

2.1 三葉青葉形差異

各資源葉長度性狀統(tǒng)計分析顯示，各資源葉形存在一定差異（見表2）。其中，中葉柄長變異系數(shù)最大（23.43%），中葉柄長最短的為ZJ-LSH，僅5.37 mm，最長的為HN-JSH，13.23 mm，為前者的2.5 倍以上；側(cè)葉柄長變異系數(shù)僅次于中葉柄長（21.64%），其中最短的僅2.70 mm（JX-FCH），最長的6.70 mm（HN-JSH）；側(cè)生葉葉片長度性狀變異系數(shù)整體大于中生葉葉片，例如側(cè)葉寬變異系數(shù)（16.33%）大于中葉寬變異系數(shù)（14.66%），側(cè)葉長變異系數(shù)（13.66%）大于中葉長的變異系數(shù)（13.17%）；其余葉形長度性狀變異系數(shù)由15.02～19.38%。

表2 三葉青葉長度性狀及總黃酮含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 2 Characters of leaf length and content of total flavonoids of T.hemsleyanum（means±SD）

2.2 三葉青葉長度性狀與比例性狀相關(guān)性

三葉青部分葉長度性狀與比例性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示（見表3），葉柄長與中葉長寬比（相關(guān)系數(shù)-0.376）和側(cè)葉長寬比（相關(guān)系數(shù)-0.390）呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），即葉柄長的資源，其葉片可能更為寬闊；中葉柄長和側(cè)葉柄長與比例性狀均無顯著相關(guān)性；中葉長和中葉寬與中葉長寬比分別呈顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.312）和極顯著負相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.500），即隨著中葉葉片增大，其葉形逐漸朝狹長或短闊形發(fā)展；中葉寬與側(cè)葉長寬比和側(cè)葉下寬比分別呈極顯著負相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.432）和顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.318），中葉長寬比與側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬和側(cè)葉下部寬呈顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.380、-0.343和-0.390，表明中生葉和側(cè)生葉葉形存在相關(guān)性，中生葉增寬，側(cè)生葉亦朝寬闊方向發(fā)展，反之亦然；側(cè)葉長與葉比例性狀無顯著相關(guān)性。側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬和側(cè)葉下部寬與側(cè)葉長寬比呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)依次為-0.482、-0.475和-0.467，表明隨著側(cè)生葉寬度的增加，側(cè)生葉葉形整體朝更寬闊方向過渡。

表3 三葉青葉長度性狀與比例性狀相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of characters of leaf length with proportion of T.hemsleyanum

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 三葉青種源地理位置與葉表觀性狀相關(guān)性

各資源種源地緯度、經(jīng)度以及海拔與三葉青葉長度性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示（見表4），種源地緯度與葉柄長呈顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.353），即隨著種源地緯度升高，葉柄長整體呈增長趨勢，而種源地緯度與中葉長、中葉寬距、側(cè)葉上寬距呈顯著負相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)依次為-0.318、-0.329、-0.287，具體表現(xiàn)為小葉由披針形或卵披針形向更為寬闊的長橢圓披針形過渡；種源地經(jīng)度與三葉青葉長度性狀無顯著相關(guān)性；種源地海拔與側(cè)葉柄長呈顯著負相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)-0.302，即隨著種源地海拔升高，三葉青側(cè)葉小柄長度呈縮短趨勢，葉片距離總?cè)~柄更近。

表4 三葉青種源地與葉長度性狀相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of provenance with characters of leaf length of T.hemsleyanum

由各資源種源地緯度、經(jīng)度以及海拔與葉比例性狀相關(guān)性分析結(jié)果可知（見表5），種源地緯度與葉柄比呈極顯著負相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.451），與中葉長寬比（相關(guān)系數(shù)-0.301）、側(cè)葉上寬比（相關(guān)系數(shù)-0.320）和側(cè)葉下寬比（相關(guān)系數(shù)-0.293）均為顯著負相關(guān)（＜0.05），具體表現(xiàn)為種源地緯度升高，三葉青葉柄逐漸增長，中生小葉變的更寬闊，側(cè)生小葉葉片朝卵狀橢圓形方向發(fā)展；種源地經(jīng)度與側(cè)葉上寬比（相關(guān)系數(shù)-0.285，）和側(cè)葉上下寬比（相關(guān)系數(shù)-0.423）分別呈顯著負相關(guān)（＜0.05）和極顯著負相關(guān)（＜0.01），即表明伴隨種源地向東推移，三葉青側(cè)生葉不對稱性更為明顯；種源地海拔與葉比例性狀無顯著相關(guān)性。

表5 三葉青種源地與葉比例性狀相關(guān)性Table 5 Correlation analysis of provenance with characters of leaf proportion of T.hemsleyanum

2.4 三葉青葉長度性狀因子分析

三葉青部分葉長度性狀與比例性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，長度性狀間可能存在普遍的相關(guān)性，因此對部分葉長度性狀進行因子分析。結(jié)果顯示，KMO 測度值0.744，Bartlett 檢驗顯著性值0.000，可進行因子分析。

因子分析結(jié)果顯示（見表6），共有3個公因子特征值大于1，經(jīng)過最大方差法旋轉(zhuǎn)后得到的公因子載荷矩陣顯示，3個公因子的累積貢獻率達90.237%，涵蓋了原變量的絕大部分信息。公因子1貢獻率為55.257%，在側(cè)葉寬、側(cè)葉下部寬、側(cè)葉上部寬、側(cè)葉長、中葉寬和中葉長上有較大載荷，代表葉片性狀；公因子2貢獻率為21.558%，在側(cè)葉柄長和中葉柄長上具有較大載荷，代表小葉柄性狀；公因子3貢獻率13.423%，在葉柄長上具有較大載荷，反應(yīng)葉柄長度性狀。各資源公因子得分及綜合得分如表7所示。

表6 葉長度性狀因子Table 6 Leaf length characters factor analysis

2.5 三葉青葉形聚類分析

以3個葉長度性狀公因子得分為數(shù)據(jù)源，進行層次聚類，求得各資源葉形綜合得分，最終將49個資源葉形劃分為5 個類型（見表7），其中湖南、江西、浙江和湖北省中的8個資源構(gòu)成一類（類型-1），該類葉形公因子綜合得分平均值在0.55 以上，葉形大小整體處于中等或中等偏上水平，這8個資源為本研究涉及資源中公因子2得分最高的資源，表明該類葉形主要特點為小葉柄較長。

表7 三葉青葉長度性狀公因子得分、綜合得分及聚類分析結(jié)果Table 7 Common factor scores，comprehensive scores and cluster analysis results of T.hemsleyanum length characters

ANH-HSH等30個資源葉形歸為一類（類型-2），種源地涉及了本研究中除云南省外的所有采集?。ㄖ陛犑校?，其中以江西、廣西和浙江資源相對較多，該類葉形公因子綜合得分多為負值，平均得分-0.38，說明該類群葉形整體偏小，公因子1、公因子2 得分為負值的絕大部分資源葉形歸入此類中，表明該類葉形主要特征為葉片較小、小葉柄較短。

JX-LHSH 和HN-JBX 等5 個資源葉形歸為一類（類型-3），種源地涉及湖南、江西和浙江，公因子綜合得分平均值為0.89，說明該類葉形整體偏大，多數(shù)資源公因子1、3 得分較高，表明該類葉形主要特征為葉片較大、葉柄較長，由葉長度性狀測量結(jié)果（見表2）可知，此類葉形側(cè)生葉較寬，中生葉與側(cè)生葉葉片長寬比較小，即葉片短闊。

JX-YSH 等5 個資源葉形歸為一類（類型-4），種源地涉及廣西和江西兩省，該類群的公因子綜合得分平均值0.11，說明該類葉形大小在本研究涉及資源中整體處于中等水平。本研究所涉資源，公因子3得分最少的5個資源全為此類型葉，表明該類葉形主要特征為葉柄較短（平均僅22.76 mm）。

云南的YN-MLP葉形單獨構(gòu)成一類（類型-5），公因子綜合得分最高（1.89），表明該類葉形為本研究中葉形整體最大的一類，其公因子1得分遠高于其他資源，說明該類葉形主要特征為葉片較大，其中葉長、側(cè)葉長、側(cè)葉寬均大于其他資源，但中葉柄長和側(cè)葉柄長在本研究資源中僅處中等水平。

2.6 三葉青地上部分總黃酮含量與種源地位置和葉形公因子的相關(guān)性

49個資源地上部分總黃酮含量檢測結(jié)果顯示（見表2），各資源地上部分總黃酮含量差異較大，變異系數(shù)為32.22%，其中YN-MLP 總黃酮含量最低，僅16.66 mg·g，ZJ-WZH 總黃酮含量最高，達74.64 mg·g。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，三葉青地上部分總黃酮含量與種源地地理位置（緯度、經(jīng)度及海拔）無顯著相關(guān)性。總黃酮含量與公因子1呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)-0.368，即葉片增大，各資源地上部分總黃酮含量整體呈下降趨勢?？傸S酮含量與公因子3呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)0.375，即各資源地上部分總黃酮含量隨葉柄長度增加而呈增長趨勢?？傸S酮含量與公因子2 無顯著相關(guān)性，即其與小葉柄長度間無明顯關(guān)系。

3 討論

分析結(jié)果顯示，不同種源三葉青栽培于同一生境，其葉形亦存在一定差異，其中以小葉柄長度（中葉柄長、側(cè)葉柄長）變異系數(shù)最大（21%以上），其次是與側(cè)生小葉片寬度相關(guān)的性狀（側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬、側(cè)葉下部寬、側(cè)葉上寬距和側(cè)葉下寬距），變異系數(shù)亦多大于16%，葉柄長、側(cè)葉長和中葉片相關(guān)性狀變異系數(shù)最小，多小于15%或在其左右，表明相較其他性狀而言，小葉柄長度及側(cè)生葉葉片性狀對于三葉青種質(zhì)資源鑒別具有更高的參考價值，且相較于莖和塊根性狀而言，具有直觀，易于獲取、實用價值更高等優(yōu)勢。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，三葉青葉柄長、中葉長、中葉寬距、側(cè)葉上寬距、側(cè)葉柄長、葉柄比、中葉長寬比、側(cè)葉上寬比、側(cè)葉下寬比與種源地緯度、經(jīng)度或海拔存在顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）相關(guān)性，表明三葉青各資源葉形差異是長期適應(yīng)種源地生境而產(chǎn)生的穩(wěn)定形態(tài)學(xué)差異，例如側(cè)葉柄長與海拔呈顯著負相關(guān)（＜0.05）可能是由于海拔升高，水分減少，小葉柄朝著短縮方向發(fā)展以便于水分和養(yǎng)分的輸送。

聚類分析結(jié)果將三葉青葉形劃分為5種類型，其中，江西包含4 種類型，江西西側(cè)的湖南和東北側(cè)的浙江2 省包含3 種類型，江西西北側(cè)的湖北包含2 種類型，其余?。ㄖ陛犑校┚鶅H包含1 種類型，各?。ㄖ陛犑校┤~青葉形種類數(shù)量整體呈以江西為中心，向周圍輻射遞減的趨勢，表明江西可能是三葉青各類種源的過渡區(qū)，甚至是遺傳多樣性的起源中心，這與尹明華等所得結(jié)論一致。此外，本研究涉及資源中，超過半數(shù)資源葉形具類型-2葉形，表明葉片較小、小葉柄較短的葉形可能更接近三葉青祖征。

本研究分析結(jié)果顯示，49 個三葉青資源地上部分總黃酮含量存在較大差異，變異系數(shù)達32.22%，但總黃酮含量與種源地緯度、經(jīng)度和海拔均無顯著相關(guān)性，這表明導(dǎo)致三葉青各資源總黃酮含量差異形成的原因，可能并不僅限于經(jīng)度、緯度和海拔影響，還可能與種源地光照等更為復(fù)雜多樣的環(huán)境因子長期作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，三葉青地上部分總黃酮含量與葉片性狀公因子（公因子1）呈極顯著負相關(guān)（＜0.01），與葉柄長度性狀公因子（公因子3）呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），即葉片越大，三葉青地上部分總黃酮含量反而可能更少，而總?cè)~柄增長，三葉青地上部分總黃酮含量卻可能越高，由此推測，即便在葉中，黃酮類物質(zhì)亦非均勻分布，且可能主要分布于葉柄或葉脈中。