邵晨霞，唐少軍，楊 祎，任 銳，吳勝蓮，靳 磊，賀月林，許 雋

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

桑黃類真菌“Sanghuang”是一類珍稀藥用大型真菌，包括桑黃屬（Sanghuangporus）、木層孔菌屬（Phellinus）、纖孔菌屬（Inonotus）、嗜藍(lán)抱孔菌屬（Fomitiporia）和擬層孔菌屬（Fomitopsis）5個(gè)屬相關(guān)菌類，寄主有桑屬（Morus）、忍冬屬（Lonicera）、丁香屬（Syringa）等植物，分布于東亞、北美洲以及非洲中部等地區(qū)[1]。關(guān)于桑黃最早記載可見《神農(nóng)本草經(jīng)》，能治療痢疾、盜汗、血崩、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)，還具有止瀉、延年等功效[2]。研究表明，桑黃類真菌含有多糖、黃酮、萜類和酚類等活性成分，因此是一類具有多種生物活性的藥用真菌[3-4]。包海鷹等[5]專家學(xué)者對(duì)粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）的生境、形態(tài)特征和藥用功效進(jìn)行了考證，認(rèn)為古代中藥“桑黃”為粗毛纖孔菌。眾多研究表明粗毛纖孔菌子實(shí)體具有多種藥用功效，如抗衰老、降血脂、抗炎抑菌、提高免疫力、抗腫瘤等，這些特性使桑黃在醫(yī)藥保健方面具有很大的應(yīng)用潛力[6-9]。

隨著人們健康意識(shí)的不斷增強(qiáng)，桑黃的藥用價(jià)值受到了廣泛關(guān)注，通過人工栽培獲得高產(chǎn)量、高活性的桑黃子實(shí)體是科研工作的重點(diǎn)研究內(nèi)容。目前桑黃主要采用段木栽培和代料袋栽的方法，但均存在生物轉(zhuǎn)化率低和生長周期長的問題，因此加強(qiáng)人工栽培的技術(shù)研發(fā)具有重要意義[10]。段木栽培需要大量消耗林木資源，使規(guī)?；耘嗍艿街萍s，因此代料袋栽應(yīng)用更廣泛。食用菌代料栽培通常以木屑、棉籽殼為主料，近年來棉籽殼價(jià)格不斷升高，栽培成本也隨之增加，需要尋找其他合適的原料來代替棉籽殼[11]。積極拓寬培養(yǎng)料來源，從而降低生產(chǎn)成本，對(duì)實(shí)現(xiàn)桑黃大規(guī)模人工栽培和滿足市場需求具有現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)于桑黃功效方面的研究主要集中在抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等[8]方面，關(guān)于抑菌活性的研究較少。因此，通過利用蓮子殼下腳料做主要原料栽培桑黃，旨在探索成本低、生物轉(zhuǎn)化率高的新型栽培基質(zhì)配方，通過測定桑黃子實(shí)體多糖、黃酮類、三萜類活性成分含量，開展子實(shí)體不同溶劑提取物的抑菌效果研究，為桑黃人工栽培產(chǎn)業(yè)發(fā)展及資源開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

供試桑黃菌株，由湖南省微生物研究院收集保藏?；贗TS序列進(jìn)行擴(kuò)增、測序，比對(duì)后鑒定為粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）。

開展抑菌活性試驗(yàn)的大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans），由湖南省疾控中心提供。

1.1.2 原種培養(yǎng)料配方

木屑配方：木屑78%，麩皮18%，麥粒2%，蔗糖1%，石膏粉1%。

木屑棉籽殼配方：木屑40%，棉籽殼38%，麩皮18%，麥粒2%，蔗糖1%，石膏粉1%。

麥粒配方：麥粒98%，蔗糖1%，石膏粉1%。

以上各配方的含水量均為55%～60%，pH自然。

1.1.3 栽培種培養(yǎng)料配方

配方1：蓮子殼粉30%、木屑40%、麥麩16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方2：蓮子殼粉40%、木屑30%、麥麩16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方3：蓮子殼粉50%、木屑20%、麥麩16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方4：棉籽殼40%、木屑30%、麥麩16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

配方5：木屑70%、麥麩16%、玉米粉10%、葡萄糖2%、石灰1%、石膏1%。

以上各配方的含水量為55%～60%，pH自然。

1.1.4 主要儀器

LDZX-75L-I立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，江蘇蘇靜儀器儀表有限公司；N-1000v-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Büchi公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-6恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原種制備

按1.1.2中3個(gè)原種培養(yǎng)料配方進(jìn)行制備。注意制備麥粒培養(yǎng)料時(shí)需先將麥粒用常溫水浸泡16 h，煮沸約20 min，至麥粒不開花、無硬芯時(shí)撈出，濾干后與蔗糖和石膏粉拌勻。采用550 mL的玻璃菌種瓶，裝料量為瓶體積的4/5，于121℃高壓滅菌2 h。無菌條件下接種，每瓶接種母種2塊～4塊，塞上棉塞。接種后在26℃遮光條件下培養(yǎng)菌絲，空氣相對(duì)濕度為55%～65%。觀察記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌絲長勢、菌絲長滿瓶的時(shí)間及菌絲顏色。

1.2.2 菌袋制備和子實(shí)體培養(yǎng)

按1.1.3所述的栽培種培養(yǎng)料配方進(jìn)行制備。蓮子殼需添加3%石灰，提前用水浸泡2 d。配好的料含水量為60%～65%，pH為7.0～7.5，當(dāng)天配料當(dāng)天裝袋后高壓滅菌。采用規(guī)格為17 cm×33 cm的聚丙烯塑料袋，每袋裝干料約400 g，于121℃高壓滅菌2 h。接種量為每瓶原種接25袋栽培種，在26℃遮光條件下培養(yǎng)菌絲，空氣相對(duì)濕度為55%～65%。待菌絲滿袋后，形成顏色稍深的瘤狀突起時(shí)及時(shí)進(jìn)行出菇管理。將菌袋立式擺放，在距離菌袋上部約3/5處，用無菌刀片劃1個(gè)長半軸為2 cm，短半軸為1 cm的橢圓口。栽培室溫度為25℃～28℃，空氣相對(duì)濕度為90%～95%，光照強(qiáng)度為300 lx～500 lx，光照時(shí)間為8 h，保持通風(fēng)以提供充足的氧氣。待子實(shí)體生長50 d～60 d，未彈孢子時(shí)及時(shí)采收，備用。

1.2.3 菌絲和子實(shí)體生長觀測

菌絲滿袋后，觀察并記錄滿袋時(shí)間和開口后原基形成時(shí)間。開口后50 d～60 d采收子實(shí)體，測量子實(shí)體烘干后的總質(zhì)量。每個(gè)配方設(shè)3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)30個(gè)培養(yǎng)袋。

1.2.4 子實(shí)體活性成分樣品制備

收集的子實(shí)體于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，粉碎，過孔徑為0.25 mm（60目）篩網(wǎng)，收集粉末，密封保存，備用。

1.2.5 粗多糖含量測定

稱取1.2.4的子實(shí)體粉末樣品各2.0 g，水浴回流提取粗多糖，料水比為1∶30，提取溫度為90℃，提取時(shí)間為2 h。4 000 r·min-1離心10 min收集上清液，重復(fù)操作2次。合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，加入無水乙醇使乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80%。4℃條件下沉淀16 h后，4 000 r·min-1離心10 min，沉淀物用蒸餾水定容至100 mL。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]。

1.2.6 黃酮類和三萜類含量測定

稱取1.2.4的子實(shí)體粉末樣品各4.0 g，用70%乙醇超聲提取，料液比為1:20，提取溫度為55℃，提取時(shí)間為60 min。4 000 r·min-1離心10 min收集上清液，重復(fù)操作1次。合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收乙醇，濃縮液用70%乙醇定容至100 mL。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定黃酮類含量。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸比色法測定總?cè)祁惡俊?/p>

1.2.7 抑菌活性試驗(yàn)

參考陳志娜等[13]的方法。稱取4份配方2培養(yǎng)料栽培的桑黃子實(shí)體粉末1.0 g，分別加入20 mL甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿，在60 Hz、40℃條件下超聲提取30 min。提取液用定性分析濾紙進(jìn)行真空抽濾，收集濾液，將殘?jiān)凑障嗤瑮l件再提取2次。合并3次濾液，于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，分別溶于10 mL二甲基亞砜中，得到4種不同溶劑提取物濃縮液（100 mg·mL-1），4℃保存，備用。

采用牛津杯法對(duì)桑黃子實(shí)體的4種不同溶劑提取物濃縮液進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。將活化后的致病菌接種到含800μL LB液體培養(yǎng)料的EP管（1.5 mL）中，在150 r·min-1、37℃條件下振蕩培養(yǎng)18 h，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的初始濃度至2×106個(gè)/mL。將100μL菌液用涂布器均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上。每個(gè)平板（直徑9 cm）放置2個(gè)牛津杯（內(nèi)徑為6 mm，高為10 mm），在牛津杯內(nèi)分別加入100μL子實(shí)體的4種不同溶劑提取物濃縮液，4種不同溶劑為陰性對(duì)照，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。采用“十”字交叉法測量抑菌圈大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并以LSD法檢測各處理平均數(shù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原種培養(yǎng)料對(duì)桑黃菌絲生長的影響

桑黃菌絲在3種不同原種培養(yǎng)料上均能生長，生長情況見表1、圖1。

表1 不同原種培養(yǎng)料培養(yǎng)桑黃的菌絲生長情況Tab.1 Mycelial growth of Inonotus hispidus cultivated in different substrates of morther spawn

圖1 不同原種培養(yǎng)料培養(yǎng)桑黃的菌絲Fig.1 Mycelia of Inonotus hispidus cultivated in different substrates of morther spawn

如表1、圖1所示，桑黃菌絲在木屑配方、木屑棉籽殼配方和麥粒配方培養(yǎng)料上的萌發(fā)時(shí)間分別為3 d、3 d、2 d，菌絲均表現(xiàn)出健壯、濃密，長勢旺盛。其中在麥粒配方中的菌絲生長邊緣最整齊，滿瓶的時(shí)間最短（21 d）。麥粒配方的菌絲顏色為深黃色，木屑、木屑棉籽殼配方的菌絲顏色為黃色。綜上，3種不同原種培養(yǎng)料均可用于桑黃原種的制備。將桑黃原種接入栽培種培養(yǎng)料進(jìn)行栽培時(shí)，麥粒配方的菌絲聯(lián)結(jié)緊密，不易散開，顆粒度較大；木屑、木屑棉籽殼配方的菌絲結(jié)合松散而較易散開，顆粒度較小。

2.2 不同栽培種培養(yǎng)料對(duì)桑黃菌絲生長和子實(shí)體形成的影響

在相同培養(yǎng)條件下，桑黃在5種不同栽培種培養(yǎng)料上均能生長，生長情況見表2。

表2 不同栽培種培養(yǎng)料培養(yǎng)桑黃的菌絲及子實(shí)體生長情況Tab.2 Growth of Inonotus hispidus mycelia and fruit bodies cultivated in different substrates of spawn

如表2所示，5個(gè)配方中菌絲均健壯、濃密。配方2的菌絲生長最快，滿袋時(shí)間最短，為31 d；配方3菌絲滿袋時(shí)間最長為36 d。子實(shí)體原基分化最快的是配方2，為11 d；其次是配方1，子實(shí)體原基分化時(shí)間為13 d；最慢的是配方4，子實(shí)體原基分化時(shí)間為17 d。

出菇后子實(shí)體生長情況見圖2。

如圖2所示，桑黃開口出菇初期顏色為淺黃色，子實(shí)體質(zhì)地致密較硬，子實(shí)體生長后期顏色逐漸加深至黃褐色，質(zhì)地稍疏松。采收期停止加濕，子實(shí)體會(huì)彈射黃色孢子。采收的子實(shí)體形態(tài)為不規(guī)則的球蓋形，表面有微細(xì)絨毛，子實(shí)體橫切面有同心環(huán)紋路。

2.3 不同栽培培養(yǎng)料對(duì)桑黃子實(shí)體活性成分含量的影響

在相同培養(yǎng)條件下，不同配方的培養(yǎng)料栽培的桑黃子實(shí)體活性成分含量有差異，詳見表3。

如表3所示。子實(shí)體粗多糖含量配方2最高，為2.69%，其次是配方3，為2.32%，顯著高于其他3個(gè)配方；子實(shí)體粗多糖含量最低的是配方5，為1.71%，顯著低于其他4個(gè)配方。桑黃子實(shí)體黃酮類含量配方2最高，為8.23%；其次是配方4，為7.67%；配方2和配方4子實(shí)體黃酮類含量顯著高于配方3（7.12%）和配方5（7.21%）。桑黃子實(shí)體三萜類含量配方1最高，為1.31%，顯著高于其他4個(gè)配方。

2.4 桑黃子實(shí)體提取物抑菌活性

桑黃子實(shí)體4種不同溶劑提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌3種指示菌都具有良好的抑制效果，詳見表4。

表4 桑黃子實(shí)體不同溶劑提取物的抑菌活性Tab.4 Antimicrobial activity of different solvent extracts from fruit bodies of Inonotus hispidus

由表4可知，對(duì)于大腸桿菌，乙酸乙酯提取物的抑菌活性最好，其次是甲醇提取物，氯仿提取物的抑菌活性最差，與其他3種溶劑提取物的抑菌活性差異顯著。對(duì)于金黃色葡萄球菌，乙酸乙酯提取物的抑菌活性最好，其次是甲醇提取物，與70%乙醇、氯仿溶劑提取物的抑菌活性差異顯著。對(duì)于白色念珠菌，甲醇提取物的抑菌活性最好，與另外3種溶劑提取物的抑菌活性差異顯著。

3 討論與結(jié)論

選擇3個(gè)原種培養(yǎng)料配方培養(yǎng)桑黃，菌絲長勢旺盛，濃密且粗壯，表明麥粒配方、木屑配方、木屑棉籽殼配方均可用于桑黃原種制種。麥粒配方的桑黃菌絲生長較快，可能是麥粒中豐富的營養(yǎng)成分利于轉(zhuǎn)化利用，多種活性物質(zhì)可促進(jìn)菌絲的萌發(fā)和生長，從而縮短栽培周期。但接種到栽培種培養(yǎng)料中時(shí)，由于麥粒培養(yǎng)料相對(duì)其他2種配方的培養(yǎng)料菌絲聯(lián)結(jié)更緊密，因接種操作耗時(shí)更長，并且麥粒的成本相對(duì)更高，因此生產(chǎn)中可結(jié)合實(shí)際，綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本等因素選擇適宜的配方。

探討了不同配方栽培種培養(yǎng)料對(duì)桑黃菌絲生長及子實(shí)體活性成分的影響，在相同培養(yǎng)條件下，添加40%蓮子殼粉的培養(yǎng)料菌絲生長最快，滿袋時(shí)間最短；添加50%蓮子殼的培養(yǎng)料菌絲生長最慢，滿袋時(shí)間最長；這2個(gè)配方栽培的子實(shí)體干質(zhì)量較高。以栽培特性為指標(biāo)，配方2可以加快菌絲生長和子實(shí)體形成，縮短栽培周期，顯著提高子實(shí)體產(chǎn)量，更適用于桑黃人工栽培。

宋永學(xué)等[11]研究不同培養(yǎng)方法和培養(yǎng)料配方對(duì)人工栽培桑黃的影響，分析認(rèn)為加入棉籽殼的老桑枝培養(yǎng)料可以促進(jìn)菌絲生長，子實(shí)體產(chǎn)量高，可能與加入棉籽殼后培養(yǎng)料的透氣性增加有關(guān)。本研究中，加入適量蓮子殼的培養(yǎng)料可以促進(jìn)菌絲生長，可能與其結(jié)構(gòu)疏松增加透氣性有關(guān)，也可能是由于菌絲分解利用蓮子殼中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等，轉(zhuǎn)化積累營養(yǎng)從而促進(jìn)生長發(fā)育，具體原因還需要進(jìn)一步探討。

目前普遍認(rèn)為桑黃類真菌中的多糖、黃酮類、萜類、多酚類等物質(zhì)具有良好的降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等活性[1,14]。Wang等[15]采用三相分配法從鮑姆桑黃菌中分離得到具有生物活性的胞外多糖，具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性。陳志娜等[13]研究桑黃子實(shí)體不同溶劑提取物中總黃酮含量、抗氧化和抑菌活性，發(fā)現(xiàn)甲醇提取物的總黃酮含量最高，具有較好的抗氧化和抑菌活性。萜類化合物是桑黃主要的生物活性成分之一，杜令娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)桑黃三萜具有較好的體外降血脂作用。試驗(yàn)中用配方2所栽培的桑黃子實(shí)體粗多糖、黃酮類含量最高，但不同栽培基質(zhì)、栽培模式對(duì)其活性物質(zhì)有何種影響等問題還有待深入研究。

對(duì)使用配方2栽培的桑黃子實(shí)體開展了抑菌效果試驗(yàn)，4種不同溶劑提取物對(duì)3種指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌）都具有一定抑制效果，但不同溶劑提取物對(duì)不同指示菌的抑菌效果存在一定差異。有研究表明枯草芽孢桿菌菌株Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠紅根病的病原菌，橡膠靈芝菌有抑制作用，可能是通過改變橡膠靈芝菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受損，擾亂物質(zhì)代謝活動(dòng)從而達(dá)到抑菌效果[17]。汪天明等[18]研究表明，桑黃正丁醇提取物BAEP對(duì)白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用，抗菌效果明確。桑黃類真菌提取的化合物可抑制某些細(xì)菌和真菌的生長[19]，Hong等[20]研究表明桑黃乙酸乙酯提取物可抑制金黃色葡萄球菌合成青霉素結(jié)合蛋白，另一方面協(xié)同β-內(nèi)酰胺抗生素增強(qiáng)抗菌作用，但桑黃抑菌活性與其有效成分的相關(guān)性和作用機(jī)制有待深入研究。

我國蓮子加工產(chǎn)生大量利用率較低的副產(chǎn)品蓮子殼，利用蓮子殼栽培桑黃對(duì)其高效利用具有重要意義。蓮子殼含有豐富的粗纖維、P和K等營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分均可被食用菌菌絲吸收利用。與其他人工栽培的食用菌相比，目前人工栽培桑黃產(chǎn)量偏低，還有很大的提升空間。為更好的開發(fā)利用桑黃，在篩選及優(yōu)化培養(yǎng)料、探索培養(yǎng)條件、提取子實(shí)體中活性物質(zhì)及應(yīng)用方面還有待深入研究，其研究成果能為桑黃的規(guī)模化人工栽培及產(chǎn)品研發(fā)提供參考。