邱成書，劉松青，劉紅玲，伍 勇，程 馳，宋 斌

（1.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130；2.特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室，四川 成都 611130；3.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、玉蕈或蟹味菇等，在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）傘菌目（Agaricales）離褶傘科（Lyophyllaceae）玉蕈屬（Hypsizygus）[1]。真姬菇主要分布于北美、歐洲、西伯利亞、日本和中國東北、云南省等北溫帶地區(qū)[2-3]。春秋冬季之際，主要生長在槭樹科（Aceraceae）、山毛櫸科（殼斗科）（Fagaceae）等闊葉樹的枯木、倒木和樹樁上[4]。真姬菇營養(yǎng)豐富，氨基酸、多糖的種類較多，具有獨特的蟹香味，并可抗氧化、提高免疫力和預(yù)防衰老等[5-6]。

簡單重復(fù)序列多態(tài)性ISSR（inter-simple sequence repeat）是加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等[7]在1994年基于微衛(wèi)星技術(shù)基礎(chǔ)開發(fā)的新技術(shù)。即基于生物體基因組中普遍存在的微衛(wèi)星序列而設(shè)計單一引物，擴增兩側(cè)的反向微衛(wèi)星序列，經(jīng)過電泳、染色，檢測有無條帶及其大小，獲取各樣品的ISSR指紋圖譜信息。真核生物的基因組中存在數(shù)量龐大的微衛(wèi)星序列，ISSR能檢測到樣品的高頻率多態(tài)性。加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)UBC（University of British Columbia）公布了一套ISSR引物（100條），研究人員僅需根據(jù)樣品選擇一條合適的ISSR引物進行擴增，就能獲取比限制性酶切片段和微衛(wèi)星更加豐富遺傳信息。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性SRAP（sequence-related amplified polymorphism）是Li等[8]在2001年研發(fā)出的一種核酸標(biāo)記技術(shù)，基于基因外顯子中（GC）含量豐富，而啟動子與內(nèi)含子中（AT）含量較高的特點，針對可讀框ORFs（open reading frame）設(shè)計引物進行擴增。不同生物體的內(nèi)含子、啟動子長度差異巨大，形成豐富多態(tài)性。SRAP是一個簡單、高效的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于植物研究，同樣也應(yīng)用于大型真菌遺傳研究中[9-10]。

真姬菇屬于珍稀食用菌品種，對其種質(zhì)資源多樣性進行必要的研究和保護，具有十分重要的意義。因此，利用收集到的幾個國內(nèi)真姬菇（含白變種）菌株，使用蔗糖馬鈴薯培養(yǎng)基進行菌絲復(fù)壯，通過不同方法提取真姬菇基因組DNA，探索真姬菇基因組最佳提取方法，后進行ISSR和SRAP試驗，為真姬菇遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗所用的真姬菇菌株（含白變種）相關(guān)信息詳見表1[11]。

表1 供試菌株信息Tab.1 Information of the test strains of Hypsizygus marmoreus

1.2 試驗試劑

蔗糖（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠；碳酸鈣CaCO3（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠；瓊脂（分析純），石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司；Omega真菌基因組提取試劑盒，美國奧美嘉生物技術(shù)公司；Taq酶、dNTP、Mg2+、mixture，天根生化科技（北京）有限公司；生工真菌基因組提取試劑盒、β-巰基乙醇（AR）、異丙醇（AR）、三氯甲烷（AR）、ISSR引物（UBC801-UBC900）、SRAP引物（前端ME1-ME13，后端EM1-EM13），生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 試驗設(shè)備

N8A78型微波爐，蘇州三星電子有限公司；Eppendorf 5810R低溫冷凍高速離心機，德國艾本德股份公司；六一DYCZ-20C電泳儀、DYCP-34A電泳槽，北京六一生物科技有限公司；島津紫外UVmini-1240分光光度計，日本島津制作所；通用Gel Iqrtecl 300凝膠成像儀，美國通用電氣公司；ABI 7500熒光定量PCR，美國Applied Biosystems公司；LRH-生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HC-2062高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；721分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；HZQ-X100A迂回振蕩器，上海一恒科技有限公司；YXQ-LS30A數(shù)顯立式高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；GHG9070電熱鼓風(fēng)干燥箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；DL-I-15臺式封閉電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；JA3003電子天平，上海衡平儀器儀表有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；SKY-100C恒溫震蕩搖床，上海蘇坤實業(yè)有限公司；SW-CG-2D雙人單面垂直超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PHS-3C酸度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHSJ磁力攪拌器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 母種擴繁

采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基進行母種的擴繁，配方為：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。將制好的試管放入高壓鍋中進行滅菌，126℃維持30 min，然后取出擺斜面。在超凈工作臺上進行接種，左手平行、并排拿起母種試管和供接種用的斜面試管，2支試管的斜面向上，管口齊平；用接種針將母種縱橫切成許多小方塊，每塊面積約為0.5 cm2；取一塊迅速放入待接種的試管斜面中前部，每支母種可以接種試管30支～40支。接種完成以后，將接種好的試管放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度控制在24℃～26℃。一般情況下，培養(yǎng)10 d～15 d就可以長滿斜面。

1.4.2 基因組提取

選用3個真姬菇菌株GDGM26168、HN-1和CBS-1提取基因組DNA，分別采用5種方法：SDSCTAB法[12]、SDS法[13]、CTAB法[14]、Omega基因組提取試劑盒和生工生物真菌基因組提取試劑盒。

1.4.3 最佳反應(yīng)體系篩選

為更好地建立適宜真姬菇ISSR分析的PCR反應(yīng)體系，對Taq酶添加量、Mg2+添加量、DNA模板添加量、dNTP添加量和引物添加量對反應(yīng)效果的影響進行探索。各試劑初始濃度分別為：DNA模板質(zhì)量濃度為20 ng·μL-1、dNTP濃度為2.5 mmol·L-1、Taq酶濃度為2.5 U·μL-1、引物濃度為10 mmol·L-1、Mg2+濃度為25 mmol·L-1。參照參考文獻[11]，選用2個真姬菇菌株FJNK-1和SM-4的基因組DNA作為模板，設(shè)計PCR體系為25μL的正交試驗L16（45），各因素水平見表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

1.4.4 ISSR引物篩選

引物篩選是ISSR分析能否成功的一個十分重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。參照參考文獻[15-17]，選取50條通用ISSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用6個真姬菇菌株GDGM26168、GDGM 26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536的基因組DNA為模板，進行ISSR引物篩選。篩選出的引物需要具有較高的穩(wěn)定性，且對每個菌株都能擴增出片段大小豐富、清晰、數(shù)目適中的PCR產(chǎn)物。

1.4.5 SRAP引物篩選

以7個真姬菇菌株GDGM26168、GDGM26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536和SM-4的基因組DNA為模板；參照參考文獻[8]以及參考文獻[18]，選用13條SRAP前端引物（正向，編號為ME1~ME13）和13條后端引物兩兩配對進行初步篩選；依據(jù)電泳條帶篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到前端引物和后端引物進行第二輪篩選；最終篩選得到試驗引物組合。

2 試驗結(jié)果

2.1 基因組提取

用5種方法提取3個真姬菇菌株（GDGM26168、HN-1和CBS-1）的基因組DNA，試驗設(shè)計詳見表3。

表3 基因組提取試驗設(shè)計Tab.3 Design of genome DNA extraction experiment

如表3所示，每個試驗設(shè)置3個重復(fù)，提取后的DNA利用電泳進行檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 不同方法提取的3個真姬菇菌株基因組DNAFig.1 Genomic DNA of three Hypsizygus marmoreus strains extracted by different methods

由圖1可知，5種方法都可以用于真姬菇基因組提取，但提取效果差異明顯。試劑盒的提取效果明顯優(yōu)于SDS-CTAB法、SDS法和CTAB法，這得益于試劑盒已優(yōu)化了影響提取效果的各類因素，并進行了程序化，減少了試驗中的人為干擾和其他影響。就基因組提取效果而言，生工生物的基因組試劑盒效果相對較好，獲得的DNA量大、完整，可用于后續(xù)研究。因此采用生工生物真菌基因組試劑盒開展后續(xù)試驗。

2.2 真姬菇PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

根據(jù)設(shè)定的因素水平設(shè)計正交試驗，詳見表4。

如表4所示，以2個菌株（FJNK-1和SM-4）為模板進行擴增，結(jié)果見圖2。

表4 真姬菇PCR反應(yīng)體系優(yōu)化正交試驗Tab.4 Orthogonal experimentof PCR reaction system optimize of Hypsizygus marmoreus

圖2 真姬菇菌株P(guān)CR結(jié)果Fig.2 PCR reaction result of genetic diversity of Hypsizygus marmoreus

由圖2可知，9號和10號試驗所得結(jié)果中條帶數(shù)量較多且較為清晰。由此篩選得到最佳的PCR反應(yīng)體系（25μL）為：質(zhì)量濃度為20 ng·μL-1的DNA模板2.0μL，濃度為2.5 mmol·L-1的dNTP 1.5μL，濃度為2.5 U·μL-1的Taq聚合酶0.5μL，濃度為10 mmol·L-1的引物各1.0μL，濃度為25 mmol·L-1的Mg2+1.5μL。

2.3 真姬菇ISSR引物篩選

以6個試驗所用的真姬菇菌株（GDGM26168、GDGM26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536）為模板DNA進行ISSR擴增，每個模板2個重復(fù)。經(jīng)預(yù)試驗，選擇退火溫度（Tm）相差不大的4條引物（UBC834、UBC842、UBC836和UBC821），以47.5℃作為Tm，結(jié)果見表5。

表5 ISSR引物篩選試驗設(shè)計Tab.5 Design of screening experiment of ISSR primers

按表5所示的組合進行試驗，電泳檢測結(jié)果見圖3。

圖3 ISSR引物篩選結(jié)果Fig.3 Results of ISSR primers screening

如圖3所示，利用UBC834和UBC836引物擴增的條帶都十分清晰，可分辨程度高。經(jīng)過3輪篩選，最終篩選得到18條穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富的ISSR引物：UBC807、UBC808、UBC810、UBC811、UBC812、UBC822、UBC823、UBC824、UBC834、UBC835、UBC836、UBC840、UBC841、UBC842、UBC853、UBC854、UBC899、UBC900。

2.4 真姬菇SRAP條件摸索

確定真姬菇最佳PCR反應(yīng)體系后，使用13條SRAP前端引物（ME1～ME13）和13條后端引物（EM1～EM13）兩兩配對，以7個菌株（GDGM 26168、GDGM26169、FJNK-1、ACCC50536、HN-1、CBS-1和SM-4）為模板進行初篩。以后端引物使用ME7為例，部分組合試驗設(shè)計見表6，試驗結(jié)果見圖4。

表6 部分SRAP引物第一次篩選試驗設(shè)計Tab.6 Design of first screening experiment of part of the SRAP primers

如圖4所示，依據(jù)擴增后條帶數(shù)量適中、清晰，容易辨認(rèn)的原則，第一輪最終共篩出前端引物8條、后端引物8條，引物信息見表7。

利用表7所示引物，以7個菌株（GDGM 26168、GDGM26169、FJNK-1、ACCC50536、HN-1、CBS-1和SM-4）為模板，所篩選出的前端和后端引物一一對應(yīng)組合開展第二輪引物篩選。試驗設(shè)計見表8，篩選結(jié)果見圖5。

表7 試驗篩選得到的SRAP正向引物和反向引物Tab.7 Forward primers and reverse primers used in SRAP test

表8 SRAP引物第二次篩選試驗設(shè)計Tab.8 Design of second screening experiment of the SRAP primers

由圖4、圖5可以看出，引物組合不同，擴增結(jié)果差異很大；不同菌株間擴增條帶大小、數(shù)量存在明顯差異，及存在多態(tài)性。經(jīng)過2次篩選，得到適宜用于開展真姬菇SRAP遺傳多樣性分析的55對SRAP引物組合，見表9。

表9 篩選出的引物對Fig.9 Selected primer pairs

圖4 SRAP引物第一次篩選Fig.4 Firstscreening of SRAP primers

圖5 SRAP引物第二輪篩選Fig.5 The second screening SRAP primers

3 討論與結(jié)論

由于食用菌富含多糖和蛋白質(zhì)，若采用適用于植物基因組DNA的提取方法提取食用菌的基因組DNA，通常效果較差。真姬菇主要含有復(fù)雜真菌多糖和其他成分，用于植物或真菌常用DNA提取方法存在提取DNA量少，且含有雜質(zhì)，導(dǎo)致DNA純度不足，對后續(xù)試驗影響較大[19]。相比之下，商業(yè)開發(fā)的植物（真菌）基因組提取試劑盒已優(yōu)化了影響試驗的多個因子，并且已程序化，可以節(jié)省時間保證品質(zhì)，用于試驗?zāi)軌驖M足后期試驗要求。因此，試驗選用生工生物開發(fā)的真菌基因組提取試劑盒。

不僅ISSR反應(yīng)體系對反應(yīng)效果有影響，引物的退火溫度的影響也十分明顯[20-21]。為了更好了解不同引物的退火溫度，試驗用溫度梯度PCR進行摸索每一條引物確定其退火溫度。確定每一條引物的退火溫度之后，選用6株菌溫度相近的多個引物同時試驗，考查不同引物對不同菌株間遺傳多樣性，以此進行2輪、3輪引物篩選，最終篩選得到適宜研究的34株菌種[11]ISSR引物。

SRAP主要是基于真核生物啟動子設(shè)計的引物，由于物種、品種間差異性，為更好地明確研究對象的遺傳多樣性，引物篩選尤為重要。本試驗中選取前端引物13條（ME1～ME13），后端引物13條（EM1～EM13）組合成169個引物對，經(jīng)過兩輪篩選，共獲得可以用于真姬菇遺傳多樣性試驗的組合55對，Li[8]和Du[10]的研究獲得的條件摸索結(jié)果相符。

此次研究中探究了適宜真姬菇基因組提取的方法及遺傳多樣性分析條件，為進一步研究真姬菇提供了一定的參考。