劉文珍，田飛焱，花麒，歐陽敏

（1.江西省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江西 南昌 330046；2.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；3.江西省水生生物保護(hù)救助中心，江西 南昌 330046）

鯉春病毒血癥病毒（SVCV），是一種彈狀病毒，在春季常能夠引起鯉科、鯰科魚類大規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥（SVC）[1]。SVC主要表現(xiàn)為急性出血和流行性敗血癥，傳染快，死亡率高，曾在歐洲、美國、日本流行，染病魚類死亡率高達(dá)90%以上，可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2][3]。SVC在世界范圍內(nèi)流行，由于該病對(duì)水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展可造成極大的威脅，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為必須申報(bào)的疫病[4]，我國也于2008年將該病列為一類動(dòng)物疫病。

SVCV的宿主范圍很廣，能感染四大家魚和其他幾種鯉科魚類以及某些非鯉科魚類，如鯉魚。其中鯉魚是最主要的、最易感染的宿主。但迄今為止，對(duì)SVC的研究僅局限于病原學(xué)、流行病學(xué)調(diào)查、檢測(cè)與診斷以及單基因水平的分子學(xué)生物研究，而關(guān)于其感染后的血液生化指標(biāo)研究還很少，本文中就用實(shí)驗(yàn)室分離出來的一株SVCV對(duì)錦鯉進(jìn)行人工感染，引發(fā)其病癥，測(cè)定該錦鯉的血液生理生化指標(biāo)，以期為錦鯉的鯉春病毒血癥的病理學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

用于人工感染試驗(yàn)的試驗(yàn)魚購自于分宜縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，為體長在11～15 cm健康錦鯉（Cyprinus carpio koi）；水族箱用循環(huán)水中暫養(yǎng)5 d，無異常后開始試驗(yàn)。SVCV病毒株是本實(shí)驗(yàn)室利用草魚卵巢細(xì)胞系從一批鯽監(jiān)測(cè)樣品中分離鑒定到的一株病毒，為JX14-012株。

1.2 方法

1.2.1 人工感染

試驗(yàn)前隨機(jī)抽取該批錦鯉25尾，取肝、脾、腎和腦按前述方法進(jìn)行病毒分離和PCR檢測(cè)，確定試驗(yàn)魚為SVCV陰性樣本。然后將剩下的魚隨機(jī)分成4組，每組15尾，暫養(yǎng)于室內(nèi)水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的4個(gè)水缸中，水溫為8℃～16℃。以JX14-012株的細(xì)胞懸液作原液，并將原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋，共3個(gè)梯度的攻毒液通過腹腔注射試驗(yàn)組，同時(shí)用正常的CO細(xì)胞懸液注射另一組作為對(duì)照組，每尾注射0.2 mL，每天觀察各組試驗(yàn)魚的發(fā)病死亡情況，試驗(yàn)過程中開增氧機(jī)、不開循環(huán)水。為了驗(yàn)證第一次感染試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，又進(jìn)行了第二次感染試驗(yàn)，將原液用含10%胎牛血清的M199以1∶10倍、1∶100倍稀釋，共3個(gè)梯度的攻毒液通過腹腔注射試驗(yàn)組，同時(shí)用正常的CO細(xì)胞懸液注射另一組作為對(duì)照組，每尾注射0.2 mL。

1.2.2 血液生化指標(biāo)測(cè)定

用無菌注射器（1 mL）進(jìn)行尾靜脈取血，置于1.5 mL離心管中，用低溫冷凍離心機(jī)，10000 r/min離心10 min，收集血清，分別測(cè)定健康錦鯉、受感染2 d和9 d的錦鯉血清中的總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（TC）、尿素氮（BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿酸（UA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、球蛋白（GLB）。所有生化指標(biāo)均在URIT-8026生化自動(dòng)分析儀上完成。第二次感染試驗(yàn)感染6 d后（出現(xiàn)明顯癥狀甚至死亡）抽血測(cè)定以上相同指標(biāo)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過Spss 24軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行ANONA分析，多重比較，P＜0.05即認(rèn)為差異顯著，所有的數(shù)據(jù)結(jié)果以樣本平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

感染SVCV的魚類一般有以下癥狀：在池塘進(jìn)水口聚集、活力下降、呼吸困難；隨后病魚出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、游速減慢、身體平衡能力降低，有些在池塘邊緣無方向性的游動(dòng)或無意識(shí)漂游；發(fā)病后期病魚幾乎停止游動(dòng)，身體傾斜，經(jīng)常臥于池底[5，6]；病魚體色發(fā)黑、眼球突出、鰓部蒼白等，眼球和體表有出血斑點(diǎn)，肌肉呈紅色[4]。在本試驗(yàn)中注射感染的錦鯉在第6天開始出現(xiàn)典型癥狀，主要表現(xiàn)為全身出血，眼球突出（圖1）、解剖病魚，發(fā)現(xiàn)鰾充血較為明顯，肛門紅腫，腹腔積水、肝脾腎腫大（圖2）。而對(duì)照組魚無病癥。

圖1 體表、鰓蓋、頭部充血現(xiàn)象

圖2 鰾充血癥狀

2.2 感染SVCV對(duì)錦鯉血清生化指標(biāo)的影響

由表1可知，人工感染后，與健康組相比較，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT均無顯著性差異，但仍然能從表中看出一些變化的規(guī)律，其中TBIL、DBIL在血清中的含量在感染2 d時(shí)有稍微的上升，在感染9 d后則有所下降，ALT、AST、ALP則均在感染2 d時(shí)數(shù)值變化不大，感染9 d后則含量有所上升。

表1 健康魚與人工感染后魚的血液生化指標(biāo)的比較

TP、ALB、GLB、HDL、LDL均在感染后濃度有所下降，但沒有顯著性差異，而是感染9 d后，血清中含量顯著下降，與健康組相比較有顯著性差異（P＜0.05）。

TG、UA則在感染2 d后濃度迅速上升，尤其是原始濃度感染組和稀釋10倍原液感染組，與健康組相比較有極限性差異（P＜0.01），但在感染后期，則其濃度極大的降低到與健康組濃度差異不大。

LDH、CREA、GLU均在感染初期變化不明顯，但在感染9 d后，含量均極顯著升高。

BUN在感染2 d后其濃度就迅速下降，至感染9 d后，其濃度與健康組相比較有極顯著性差異（P＜0.01）。

由表2中可以看出第二次的試驗(yàn)基本驗(yàn)證了第一次感染試驗(yàn)的結(jié)果，TBIL、DBIL、TC、ALT、AST、ALP、GGT、TG、UA均無顯著性差異，其中TG、UA符合第一次感染試驗(yàn)時(shí)感染初期變化明顯而感染后期變化不明顯的規(guī)律。而TP、ALB、GLB、HDL、BUN含量則顯著下降，LDH、GLU、CREA在感染后含量顯著上升，均與第一次感染試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 第二次感染試驗(yàn)后錦鯉的血液生化指標(biāo)比較

3 討論

3.1 關(guān)于血液生化參數(shù)變化及生理意義的分析

綜合兩次感染試驗(yàn)可以看出，在感染初期（2 d左右），與正常值相比較，只有TG、UA、BUN三個(gè)指標(biāo)變化明顯，其中UA、TG后期并無顯著性變化，因此建議可以使用TG、UA、BUN三個(gè)指標(biāo)做為SVC疾病初期的診斷參考指標(biāo)。而在感染后期（6～9 d），與正常值相比較，TP、ALB、GLB、HDL、LDH、GLU、CREA均有明顯變化，可以做為SVC疾病后期的診斷參考指標(biāo)，此時(shí)有些錦鯉也開始出現(xiàn)一些典型癥狀，這與錦鯉血液生化指標(biāo)的變化相對(duì)應(yīng)。

3.2 個(gè)別參數(shù)變化及生理意義分析

如，錦鯉受到病毒攻擊，肌肉充血，肌肉組織受到破壞，肌酸代謝產(chǎn)物CREA在血清中含量明顯增加，表明肌肉組織受損嚴(yán)重。LDH含量增高，也是錦鯉肌肉組織受損的表征，這能加速受感染錦鯉的死亡。血液中的ALB主要功能是維持血液的滲透壓，GLB主要參與脂類和溶脂類物質(zhì)的運(yùn)輸以及機(jī)體免疫反應(yīng)。而兩者之和的TP是機(jī)體蛋白質(zhì)的來源，常用于修補(bǔ)組織和能量補(bǔ)給。本試驗(yàn)中TP、白蛋白、球蛋白均在感染后濃度下降，尤其是感染9d后，血清中含量顯著下降，與健康組相比較有顯著性差異，這說明肝細(xì)胞受損蛋白質(zhì)合成功能減退，這是反映魚體受病毒攻擊的重要指標(biāo)。因此，檢測(cè)錦鯉的血液生化指標(biāo)能夠在錦鯉的疾病診斷中起到重要的作用。