陳純，黃藤波，林燕翠，曹濤*，李廣鵬，甘慧

（1.深圳市億騰檢測科技有限公司，廣東 深圳 518100；2.廣東省檢迅檢測科技有限公司，廣東 東莞 523843；3.深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測科技有限公司，廣東 深圳 518100；4. 深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳 518101）

水產(chǎn)品加工包括以魚、蝦、蟹、貝、藻類等可食用部分制成冷凍品、腌制品、干制品、罐頭制品與熟食品等的食品加工業(yè)，是漁業(yè)生產(chǎn)的延續(xù)。廣東省是我國南部水產(chǎn)品盛產(chǎn)的地區(qū)之一，其水產(chǎn)加工食品在全國首屈一指，而水產(chǎn)食品的儲藏問題是一大難題。苯甲酸是食品工業(yè)中常用的一種防腐劑，對霉菌、酵母和細菌有較好的抑制作用[1]。長期食用苯甲酸超標的食品，可能導致肝臟積累性中毒，危害肝臟健康[2]?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2760-2014）中規(guī)定，苯甲酸及其鈉鹽（以苯甲酸計）在水產(chǎn)動物類罐頭中不得使用[3]。水產(chǎn)動物類罐頭中檢出苯甲酸及其鈉鹽（以苯甲酸計）的原因，可能是生產(chǎn)企業(yè)為延長產(chǎn)品保質(zhì)期，或者彌補產(chǎn)品生產(chǎn)過程衛(wèi)生條件不佳而超范圍使用[4]。

常用檢測苯甲酸的方法有分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法、動力學熒光法、電位滴定法、離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相/氣相色譜-質(zhì)譜法等[5-10]。目前膠體金免疫層析技術具有快速、容易、便宜、有效、安全的特性。這比傳統(tǒng)的儀器方法要方便很多。食品中的非法添加劑及農(nóng)獸藥殘留結果目前需要檢測速度快，現(xiàn)場檢測，并能讓人直觀地用肉眼進行檢測分析。如今快速測試食品污染物能夠縮將以前1天才能完成的試驗縮短到現(xiàn)在的30分鐘[11,12]。本實驗構建水產(chǎn)品中苯甲酸快速檢測單克隆抗體，為后續(xù)生產(chǎn)水產(chǎn)品中苯甲酸快速檢測試紙條打下堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

苯甲酸標準品、二甲基亞砜（DMSO）、融合劑（PEG/DMSO Solution）、弗氏不完全佐劑（FIA）、弗氏完全佐劑（FCA）、二硫蘇糖醇、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、顯色液、辣根過氧化物酶-羊抗鼠、IgG 抗體、卵清蛋白（OVA）購自Sigma公司；胎牛血清、HAT、HT選擇培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco 公司；蛋白 Marker購自Fermentas公司；小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒購自上海金博生物有限公司；Tween-20、丙烯酞胺、雙甲基丙烯酞胺購自Solarbio公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀（均為分析純）購自天津化學試劑三廠；磷酸二氫鈉、檸檬酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉（均為分析純）購自北京化學試劑廠。

1.2 主要儀器與耗材

恒溫培養(yǎng)箱（型號：YY0027-90）上海躍進醫(yī)療器械有限公司；酶標儀（型號：Model 680）BIO-RAD公司；臺式電子天平Sartorius 公司；CO2培養(yǎng)箱Thermo公司；生物安全柜LABCONCO公司；熒光顯微鏡ZEISS公司；臺式離心機Beckman公司；倒置顯

微鏡（型號：CK31）Olympus公司；細胞培養(yǎng)板、96 孔酶標板、細胞凍存管CORNING公司

1.3 試驗動物和細胞

7周齡BALB/C小鼠購自北京實驗動物中心。小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0 細胞由本實驗室保存。

2 試驗步驟與方法

2.1 苯甲酸人工抗原的制備

將60 mg牛血清白蛋白溶于1 mL水中，加入40 μL 1 mol/L NaOH，30 μL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，室溫反應24小時。對生理鹽水透析過夜。另將4.5 mg對羥基苯甲酸溶于80 μL 1 mol/L NaOH，加入上述BSA溶液中，室溫反應48小時，對PBS透析兩天，作為免疫原。包被原的制備同上，用卵清蛋白代替牛血清白蛋白。

2.2 苯甲酸人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外圖譜的掃描

用PBS與相應的BSA、OVA、DC-BSA及DC-OVA配成一定濃度，在200～400 nm波長下進行紫外光譜圖掃描，觀察吸收峰的變化。

2.2.2 偶聯(lián)比的測定

偶聯(lián)比就是計算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率，其方法是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量的原理建立起來的。本文采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法測定偶聯(lián)物偶聯(lián)比。

將蛋白用蒸餾水配制成濃度為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液，取0.5 mL加入到0.5 mL pH 9.0的碳酸鹽緩沖液（0.1 mol/L Na2CO3、NaHCO3）中，再加入0.5 mL 0.1%的TNBS溶液，在室溫下反應15 min，于420 nm波長下進行比色。

根據(jù)吸光值和蛋白濃度作出標準曲線，曲線斜率即為標準蛋白單位濃度的吸光值。將免疫抗原用蒸餾水配制成濃度為0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液，其余步驟與上述標準曲線操作相同，做出標準曲線，曲線斜率即為單位濃度的吸光值。同時進行抗原氨基消耗率的計算。

用于連接小分子半抗原常用的載體蛋白有BSA、KLH、OVA、HSA等。其中由于BSA和OVA來源豐富且價格便宜應用的最多。BSA由于可連接半抗原的賴氨酸活性基團較多，理論上一個BSA分子上有56個賴氨酸活性基團，因此常用作于免疫原的載體蛋白。OVA可連接半抗原的賴氨酸活性基團只有20個，因此常用作于包被原的載體蛋白。本文分別采用BSA和OVA作為免疫原和包被原的載體蛋白。將人工抗原的氨基消耗率與載體蛋白氨基個數(shù)相乘即可得出人工抗原中半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比。

在200～400 nm間分別對各抗原和包被原的紫外吸收光譜進行測定，鑒定半抗原與BSA和（或）OVA是否偶聯(lián)成功，并計算偶聯(lián)比。

2.2.3 動物免疫試驗

取6周齡～8周齡健康 BALB/c 小鼠雌性4只，雄性4只。按照性別分為2組，分別免疫苯甲酸人工抗原。取一定量-20℃保存的BA免疫原，用生理鹽水稀釋，再加入等體積的佐劑，于快速混勻器上混勻，充分乳化。免疫過程參見表1。

2.3 單克隆抗體的制備

具體單克隆抗體制備過程及腹水的制備純化參見參考文獻（楊帆，2010）。

2.4 鑒定單克隆抗體的免疫學特性

2.4.1 抗體亞型的測定

收培養(yǎng)好的集雜交瘤細胞上清液，根據(jù)小鼠單抗亞型試劑盒說明書采用間接ELISA法測定。

2.4.2 抗體效價的測定

2.4.2.1 包被

將包被抗原用稀釋到2 μg/mL，用每種濃度的包被抗原分別包被兩行，置于4℃過夜，100 μL/孔。

2.4.2.2 洗滌

洗板機上洗滌3遍，洗滌液300 μL，甩干。

2.4.2.3 封閉

甩干孔內(nèi)液體，放37℃烘箱過夜烘干。

2.4.2.4 加樣

除最前面一列孔加入陰性血清作為對照組外，其余各列孔加入從第一孔開始的倍比稀釋的待檢血清，每孔100 μL，37℃反應40 min，洗滌同2。

2.4.2.5 加二抗

每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠IgG（10000稀釋），37℃反應30 min，洗滌同2。

2.4.2.6 顯色

加入顯色液100 μL，37℃、10 min，50 μL的終止液以終止反應。

2.4.2.7 測定

測定各孔Abs450nm的值。

2.4.2.8 判定結果

Abs450nm＝1.0左右的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗血清的ELISA效價。

2.4.3 間接競爭ELISA最佳工作條件的確定及其標準工作曲線的建立

為進行抗血清特異性及靈敏度測定，首先對抗原包被濃度和抗血清稀釋倍數(shù)進行優(yōu)化。本研究采用最大抑制法進行測定，即測算每個不同包被及抗血清稀釋倍數(shù)下對相同濃度藥物的B/B0值，B/B0值最小為抑制效果最好，反應靈敏度最高，該條件即為最佳包被濃度和最佳抗體稀釋倍數(shù)。根據(jù)測定結果，0藥物濃度孔的吸收值記為B0，各濃度藥物孔的吸光值記為B，由下式計算抑制率：

試驗以抗血清效價以及Abs450nm/IC50比值來表征抗血清特性，效價越高、Abs450nm/IC50越大，其相應小鼠特性最好，表明其免疫抗原或免疫方式效果最好。按照上述方法在不同的包被濃度、抗體濃度、二抗?jié)舛?、一抗反應時間、二抗反應時間、緩沖溶液體系、吐溫-20含量等條件進行優(yōu)化，在確定最佳條件時，繪制間接競爭ELISA標準曲線，用Originlab進行四參數(shù)擬合，計算曲線IC50值、Abs450nm值。通過對苯甲酸單克隆抗體及多克隆抗體最優(yōu)ELISA工作各條件的優(yōu)化，在最優(yōu)的工作條件基礎上確定不同包被原間的ELISA標準工作曲線。

2.4.4 靈敏度測定

在確定最佳條件時，試驗以間接競爭ELISA標準曲線的Abs450nm/IC50比值來表征ELISA反應靈敏度，Abs450nm/IC50越大，建立的ELISA方法靈敏度就越高。

2.4.5 特異性鑒定

抗體對其他藥物的靈敏度越高，交叉反應率越大，反之越小。以苯甲酸IC50值作為對照，抗體對苯甲醇、苯酚、青霉素、螺旋霉素、土霉素、四環(huán)素等其他藥物的交叉反應計算為：

交叉反應率(%)＝IC50(苯甲酸)/IC50(競爭物)×100%

測定競爭藥物分別為稀釋的有機物標準品、以藥物濃度100 ppb、500 ppb、1 ppm、3 ppm、9 ppm、27 ppm、81 ppm、243 ppm、2000 ppm做競爭曲線，計算各競爭物的IC50。同時，用上式計算各競爭物與對應抗體的交叉反應率。

3 結果與討論

3.1 紫外掃描圖譜分析

采用活潑酯法合成人工抗原，紫外可見光譜掃描鑒定人工抗原，在200～400 nm間分別對各抗原和包被原的紫外吸收光譜進行測定，鑒定半抗原與BSA和OVA是否偶聯(lián)成功。由圖2和圖1可以看出，相比半抗原（最大吸收262 nm）和載體蛋白（最大吸收280 nm），人工抗原的特征吸收已經(jīng)發(fā)生明顯藍移。這是因為在載體蛋白上成功偶聯(lián)半抗原后，半抗原最大吸收和載體蛋白最大吸收相互疊加，導致其最大吸收發(fā)生藍移。從紫外光譜掃描結果可以判定BA人工抗原合成成功。包被原的紫外吸收光譜也發(fā)生了變化，雖然戊二醛偶聯(lián)使吸收光譜在超過300 nm出現(xiàn)了吸收，干擾了峰的對比，但用抗血清檢測，包被原出現(xiàn)了很強的信號，證明對氨基苯甲酸已經(jīng)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上。

圖1 苯甲酸免疫/包被抗原紫外掃描圖

圖2 BSA和OVA的標準曲線

3.2 偶聯(lián)比的確定

如圖2中所示，BSA的標準曲線為y＝0.0432+0.294X（R2＝0.99786）、OVA標準曲線為 y＝0.0443+0.1865X（R2＝0.99893）。根據(jù)2.2.2的測定方法，計算出偶聯(lián)比BA-BSA為17∶1，BA-OVA為19∶1。

3.3 免疫小鼠血清滴度的測定和競爭分析

10只小鼠免疫三次后，尾靜脈采血，BA-OVA稀釋成1 μg/mL，包被酶標板，測定小鼠血清的滴度和對苯甲酸的競爭。

從表2和表3可以看出，小鼠產(chǎn)生了較高滴度的抗體，并且對苯甲酸有識別反應。

表2 小鼠血清的滴度實驗

表3 小鼠血清的競爭實驗

3.4 雜交瘤細胞株的建立及小鼠染色體計數(shù)

本次實驗選取序號為5的小鼠進行融合，共鋪設了4塊96孔板。8天時，雜交瘤細胞孔為251個，融合率為65.4%。一天后再取培養(yǎng)上清用間接ELISA進行檢測，其中的陽性孔有42個，陽性率為16.7%；取上清進行靈敏度篩選，隨機選取其中10個孔最終得到4株雜交瘤細胞株：J3C4、J5F4、J8C1、J8B5。細胞見圖3和圖4。

圖3 骨髓瘤細胞顯微鏡下狀態(tài)

圖4 雜交瘤細胞J5F4

從表4和表5可以看到得到了識別苯甲酸的較高靈敏度的單克隆抗體。

表4 苯甲酸單克隆抗體的細胞株培養(yǎng)上清滴度測定

表5 苯甲酸單克隆抗體細胞株培養(yǎng)上清的競爭實驗

顯微鏡下，SP2/0細胞染色體50～60條，小鼠脾細胞染色體40條，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目大約為90～100條，直接證明了細胞融合成功，免疫小鼠的脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞SP2/0共同構成了雜交瘤細胞中的染色體，J3C4的染色體數(shù)為90，J5F4的為92，J8C1的為92，J8B5的為95，證明都是二者融合的細胞株。見圖5和圖6（以J5F4為例）。

圖6 雜交瘤細胞染色體

3.5 抗體亞型及效價測定

參考試劑盒相應的說明書，采用間接ELISA法，證明細胞株J3C4，J8C1單抗為IgG1型，細胞株J5F4，J8B5單抗為IgG2a型。

以Abs450nm＝1.0左右的抗體最高稀釋倍數(shù)作為后實驗以此細胞株為準）做進一步實驗。按照選定的最優(yōu)包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)，梯度稀釋苯甲酸標準品，采用間接競爭ELISA工作程序測定抗血清對苯甲酸的競爭曲線，計算曲線IC50值。以BA-OVA為包抗體的ELISA效價。檢測結果表明，細胞培養(yǎng)上清和腹水分別達到1∶2～15×102和1∶5～20×104。

3.6 抗體靈敏度的測定

根據(jù)滴度和競爭實驗，選取J5F4細胞株抗體（以被原，建立間接ELISA 標準曲線。該方法的IC50為225.3 ng/mL，線性范圍為52.48～1824.2 ng/mL，LOD為21.33 ng/mL。

3.7 抗體特異性的測定

由表6可知，BA McAb對苯酚、苯甲醇的IC50分別為2354.8 ng/mL、3574.3 ng/mL，交叉反應率分別為9.57%、6.30%。可見該單克隆抗體與其他競爭藥物無交叉反應性，具有較好的特異性。

圖7 血清抗體對苯甲酸的競爭曲線

表6 單克隆抗體的交叉反應率

4 結論

本實驗采用1,4-丁二醇二縮甘醚把半抗原和載體蛋白進行了偶聯(lián)制備了免疫原；用戊二醛法制備了包被原，紫外光譜法對改造的抗原進行了初步鑒定。用BA-OVA為包被原，篩選出4株分泌抗BA抗體的雜交瘤細胞；通過動物免疫試驗進一步驗證；采用體內(nèi)誘生法制備單抗腹水，并用辛酸-硫酸銨法和DEAE纖維素柱進行純化；對獲得的單克隆抗體進行亞型鑒定；建立間接ELISA和間接競爭ELISA法對血清多克隆抗體的效價和特異性進行了測定。經(jīng)測定，單克隆抗體腹水效價為l∶5～20×l04，其中一株抗體（J5F4）對苯甲酸的IC50為225.3 ng/mL；同苯酚、苯甲醇的交叉反應率分別為9.57%和6.30%，得到的抗體特異性較好，可以應用于免疫學檢測中。結果表明制作的改造抗原偶聯(lián)是成功的，并且利用小鼠免疫方案可行性是很好的，為后續(xù)水產(chǎn)品中苯甲酸快速檢測試紙條的制作打下堅實的基礎。