趙恒，陳富安，趙慧君，王玉榮，郭壯，張振東*

(1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.谷城農韻土特產品開發(fā)有限公司，湖北 襄陽 441053)

腐乳也被稱為“東方奶酪”，是一種發(fā)酵豆制品，其歷史最早可追溯到三國時期[1]。由于腐乳獨特的風味與營養(yǎng)價值，通常被用作日常調味，每年在中國的產量可達300萬噸[2]。根據制作腐乳所使用的微生物類型，腐乳可被分為毛霉型(包括根霉、毛霉)腐乳、細菌型腐乳(用芽孢桿菌或者微球菌發(fā)酵)、自然發(fā)酵型腐乳(發(fā)酵過程中未人工接種特定的微生物)。根據腐乳的色澤與風味，又可以將腐乳分為紅方腐乳、青方腐乳、白方腐乳、醬腐乳、花色腐乳等[3]。

近年來，由于高通量測序技術的成本低、通量高、可以快速產生大量的數據，且可以避免培養(yǎng)條件的限制，能客觀地反映微生物多樣性，被用于分析微生物的群落結構，該技術也被引入對腐乳的研究[4]。類似其他類型的發(fā)酵食品[5-7]，腐乳中常見的微生物有霉菌(包括毛霉、根霉等)、酵母(包括裂殖酵母、假絲酵母、畢赤酵母)，細菌有乳球菌屬、四球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬和短桿菌屬[8-9]。這些微生物可以通過代謝作用，代謝蛋白質、氨基酸、肽、有機酸、酯類等產生呈味小分子化合物。然而，不同地區(qū)制作腐乳的工藝與加工環(huán)境的差異，使得不同地區(qū)與不同類型的腐乳微生物多樣性差別均較大。不同腐乳的微生物差異大多與化學特征相關聯(lián)，例如鹽度、乙醇含量和一些營養(yǎng)元素含量，而微生物的代謝作用又能影響腐乳化學成分的組成，導致不同腐乳的風味差異。

湖北襄陽市茨河鎮(zhèn)與恩施州利川地區(qū)出產的花色腐乳風味較好，遠近聞名，可能蘊含獨特的菌群結構，然而對其研究尚少。因此，本研究以采集到的利川和茨河花色腐乳為研究對象，基于高通量測序技術分析這兩個地區(qū)腐乳的菌群結構，并對它們的菌群進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花色腐乳：茨河與利川花色腐乳,分別采集自湖北省襄陽市谷城市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣。

試劑：引物SSU0817F/SSU1196：武漢天一輝遠生物科技有限公司；dNTPs Mix、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer：寶生物工程(大連)有限公司；E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司。

1.2 主要儀器與設備

Vetiri型梯度基因擴增儀 美國ABI公司；WD-9413B型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；ND-2000C型微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品分別采集于湖北省襄陽市谷城市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣，且不同編號樣品采集于不同商家或者農戶家中。首先取無菌瓶裝入無異味的花色腐乳樣品，然后放入樣品箱中，迅速帶回微生物實驗室備用。茨河腐乳14個樣品編號記錄為CH1～CH14，利川腐乳8個樣品編號為LC1～LC8。

1.3.2 腐乳樣品DNA提取、PCR擴增與高通量測序

腐乳樣品的DNA提取使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒，按照說明書進行。將提取到的DNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，參照Li等[10]的方法，以真菌18S核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)817～1196區(qū)帶有barcode的通用引物SSU0817F與SSU1196進行PCR擴增。PCR程序與體系均參照Li等的方法進行。PCR產物使用瓊脂糖凝膠電泳儀與微量紫外分光光度計檢測，然后在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina MiSeq第二代測序平臺完成測序。

1.3.3 生物信息學分析

將MiSeq測序平臺產生的原始序列基于Qiime 1.9.2平臺進行生物信息學分析[11]，大致步驟如下：首先去掉低質量序列，使用FLASH將雙末端序列基于重疊區(qū)域合并，去掉接頭；按照97%的相似度使用UCLUST聚類產生分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，使用UCHIME去掉嵌合體，使用RDP分類器基于Silva的18S 核糖體RNA數據庫對OTU的代表性序列進行分類鑒定。使用QIIME平臺自帶程序計算腐乳樣品的α與β多樣性。

1.3.4 統(tǒng)計分析與作圖

使用非參數克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)對組件差異進行檢驗；使用R包vegan v2.5-7(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)進行非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析與非參數多元方差分析(PerMANOVA)分析；使用R包randomForest v4.6-14進行隨機森林分析(https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/)。文中所有圖使用Origin V8.5或者R包ggplot2完成。

2 結果與分析

2.1 腐乳微生物多樣性分析

本研究共采集了22個腐乳樣品，分別來自茨河鎮(zhèn)(n=14)和利川市(n=8)，以真菌的18S序列為靶點，進行MiSeq測序，將低質量序列去除，去掉嵌合體后，共得到630條和234條序列，茨河的腐乳樣品平均27585條，而來自利川的腐乳平均每個樣品30504.88條序列(見表1)。經過分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類后，茨河腐乳樣品平均得到623個OTU，而利川腐乳樣品平均得到286個OTU。然后選擇每個OTU的序列進行鑒定，兩個地區(qū)的腐乳樣品得到平均的分類單元相近，結果見表1。

表1 茨河與利川花色腐乳樣品的序列與微生物多樣性

續(xù) 表

對來自襄陽市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣的腐乳樣品α多樣性進行了計算，當測序深度為20010條時，香濃曲線變得平緩，表明當前樣品的測序數量能夠反映實際樣品菌群結構。兩個地區(qū)腐乳樣品的α多樣性指數的分析結果見圖1。

圖1 茨河和利川兩地腐乳α多樣性

由圖1可知，采集自茨河的腐乳樣品的Chao1指數和發(fā)現(xiàn)物種指數顯著高于利川腐乳樣品，而它們之間的香農指數和辛普森指數沒有顯著差異，表明這兩個地區(qū)的腐乳真菌多樣性存在差異，茨河腐乳物種豐富度較高，后續(xù)進一步通過菌群分析來明確其差異的真菌物種組成。

2.2 腐乳群體結構分析

將相對含量大于1%的分類單元定義為優(yōu)勢分類單元。對兩地的腐乳樣品真菌分析見圖2。采集自茨河的樣品共有3個優(yōu)勢菌門，分別為子囊菌門(Ascomycota，82.75%)、擔子菌門(Basidiomycota，10.63%)、毛霉菌亞門(Mucoromycotina，5.76%)，而利川腐乳樣品共有2個優(yōu)勢菌門，分別是子囊菌門(90.34%)、擔子菌門(8.78%)，由此可知子囊菌門是茨河與利川腐乳樣品共有的絕對優(yōu)勢菌門。使用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)，結果表明，茨河與利川腐乳樣品間的這3個菌門的相對含量差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 茨河與利川花色腐乳優(yōu)勢門組成

對兩個地區(qū)的花色腐乳進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)來自茨河的腐乳樣品共有9個優(yōu)勢屬：Galactomyces(37.80%)、畢赤酵母屬 (Pichia，25.32%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces，6.45%)、巴克斯霉屬(Backusella，5.57%)、絲孢酵母屬(Trichosporon，5.32%)、假絲酵母屬(Candida，4.70%)、Guehomyces(4.63%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，4.06%)、鐮刀菌屬(Fusarium，1.14%)；而利川腐乳樣品優(yōu)勢屬為Galactomyces(31.25%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces，28.20%)、畢赤酵母屬(Pichia，10.95%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，9.53%)、絲孢酵母屬(Trichosporon，5.02%)、曲霉屬(Aspergillus，3.96%)、節(jié)擔菌屬(Wallemia，2.83%)、鐮刀菌屬(Fusarium，1.78%)、假絲酵母屬(Candida，1.41%)。

圖3 茨河與利川花色腐乳優(yōu)勢屬組成

盡管茨河和利川花色腐乳都有9個優(yōu)勢菌屬，但是它們的優(yōu)勢屬組成并不相同，茨河腐乳與利川腐乳相比少了節(jié)擔菌屬，而利川腐乳與茨河腐乳相比少了巴克斯霉屬。真菌是腐乳發(fā)酵制作過程中起主要作用的微生物菌種之一[12]，然而目前報道較少。石黎琳等[13]對重慶地區(qū)的腐乳分析表明，腐乳成品中優(yōu)勢真菌為子囊菌門(Ascomycota)，優(yōu)勢真菌屬為鏈格孢屬(Alternaria)和赤霉菌屬。另一項針對毛霉型腐乳的研究顯示[14]，假絲酵母屬、毛霉屬、曲霉屬、絲孢酵母屬和紅曲霉屬為優(yōu)勢真菌。紅腐乳成品中優(yōu)勢真菌為紅曲霉屬和曲霉屬[15]。湖南白溪腐乳的優(yōu)勢真菌為地霉菌屬(Geotrichum)和被孢霉屬(Mortierella)。由此可見，不同地區(qū)及類型的腐乳中真菌類群差異很大，而花色腐乳與這些腐乳相比，優(yōu)勢真菌的數量更多，菌群組成更為多樣，且值得注意的是，花色腐乳中相對含量最高的優(yōu)勢屬為Galactomyces，在其他腐乳中并未報道過。

Galactomyces在利川與襄陽的花色腐乳中都是主要真菌。該屬一些真菌如Galactomycescandidum，Galactomycesgeotrichum等是常見的腐敗霉菌，能在牛乳和奶酪等乳制品及一些釀造酒中被分離到，因此這些種能在較低的pH和水分活度的環(huán)境中生存，也有研究將這種霉菌與其他真菌一起使用來制作奶酪。原因是該菌能降解奶酪中的苦味肽，減少奶酪的苦味，還能形成大量的風味物質[16-17]和一些營養(yǎng)物質如維生素B2、麥角甾醇和海藻糖[18]，因此該屬一些種是食品發(fā)酵的重要菌種。然而，該菌也能引起食品的腐敗和植物病害，是常見的腐敗菌[19]。因此，我們推測，Galactomyces可能含有豐富的蛋白酶和肽酶，能適應腐乳這種較低水分活度的環(huán)境，并可能對腐乳特殊風味的產生具有重要的作用，遺憾的是目前針對該菌對富含植物蛋白的發(fā)酵食品的作用研究尚少。

相對含量排在Galactomyces之后的真菌是畢赤酵母屬和德巴利酵母屬，在利川與茨河花色腐乳中的相對含量都超過了5%。德巴利酵母和畢赤酵母通常能從食品、土壤、水、植物和一些感染的臨床樣本中分離到。畢赤酵母屬和德巴利酵母屬都屬于油脂酵母，能在細胞內積累油脂，少數德巴利酵母能在細胞內積累自身生物量20%～70%的油脂，因此能耐受高滲環(huán)境，如在含有高達4 mol/L氯化鈉和5%葡萄糖的培養(yǎng)基和食物中生長[20-21]。腐乳中常見的畢赤酵母屬、德巴利酵母和威克漢姆酵母屬也是亞洲和非洲谷物發(fā)酵食品中起到主要作用的微生物類群，有助于改善不含酒精類發(fā)酵食品的滋味、風味、酸度、消化性和質構[22]。

基于非參數的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)對這兩個地區(qū)的優(yōu)勢真菌屬的相對含量進行了統(tǒng)計分析，結果表明，茨河與利川兩個地區(qū)的腐乳樣品間3個菌屬的相對含量存在顯著差異，它們分別是曲霉屬、巴克斯霉屬和威克漢姆酵母屬。茨河腐乳中的曲霉屬、威克漢姆酵母屬的相對含量顯著低于利川腐乳，而茨河腐乳中的巴克斯霉屬相對含量則極顯著高于利川腐乳樣品。我們基于兩個地區(qū)的真菌OTU表，利用Bray-Curtis距離矩陣進一步做了非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析。

2.3 茨河與利川腐乳菌群差異分析

由茨河與利川的物種多樣性與菌群組成分析可知，這兩個地區(qū)的腐乳菌群在屬水平上存在差異，進一步對茨河與利川腐乳樣品基于OTU相對含量進行非度量多維尺度分析，結果見圖4。

圖4 茨河與利川花色腐乳NMDS(a)與隨機森林分析(b)

由圖4中a可知，茨河腐乳樣品與利川腐乳樣品呈現(xiàn)分離的趨勢，且沒有交集產生，進一步證實了兩地腐乳菌群結構的差異。同時通過非參數多元方差分析(PerMANOVA)證實了茨河與利川腐乳樣品菌群組成差異顯著(P<0.05)。由圖4中b可知，使用隨機森林分析尋找屬水平上導致茨河地區(qū)與利川地區(qū)菌群差異的標志物種。結果顯示，導致兩個地區(qū)腐乳樣品菌群差異的主要菌屬有巴克斯霉屬、曲霉屬和威克漢姆酵母屬。前面的統(tǒng)計分析顯示茨河與利川腐乳樣品間這3個真菌屬的相對含量存在差異。結合圖4中b，它們的貢獻度中巴克斯霉屬最高，曲霉屬次之，緊接著是威克漢姆酵母屬。

巴克斯霉屬在進化關系上與毛霉相近，該屬目前有14種水平的分類單元，其分離來源多數為土壤、落葉和食草動物的糞便[23-24]。值得注意的是，本研究首次從發(fā)酵食品腐乳中發(fā)現(xiàn)大量存在這種菌，該屬微生物多數能以葡萄糖為唯一碳源進行生長，但僅部分種能利用蔗糖。腐乳富含植物蛋白，然而目前尚沒有關于巴克斯霉對于蛋白質、多肽和氨基酸的代謝研究，也沒有該菌對食品品質的研究。

3 結論

襄陽市茨河與利川花色腐乳的真菌多樣性具有顯著差異，它們的共同優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔子菌門，共同優(yōu)勢屬為Galactomyces、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬、Guehomyces、威克漢姆酵母屬和鐮刀菌屬。對茨河與利川腐乳菌群差異貢獻度最高的3個真菌屬為巴克斯霉屬、曲霉屬和威克漢姆酵母屬，可能是兩者風味差異的重要因素。