張夢(mèng)婷，李斌，田靜

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

流行病學(xué)研究表明，飲茶具有多種健康益處，日常生活中長(zhǎng)期習(xí)慣性飲茶與高血壓發(fā)病率和認(rèn)知障礙風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)［1-2］。綠茶中含量最多的茶多酚是兒茶素類物質(zhì)，而兒茶素中又以表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）含量最高，約占總量的50%～75%［3］。作為兒茶素中最有效的活性成分，EGCG具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用［4］。茶黃素類物質(zhì)（theaflavins，TFs）主要是由兒茶素及其衍生物在多酚氧化酶等酶的催化作用下氧化縮合而成的具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的一類化合物的總稱［5］，在紅茶中的含量約為0.5%～3%，是決定紅茶品質(zhì)的關(guān)鍵成分，影響紅茶口感的醇厚度與鮮爽度［6］。目前發(fā)現(xiàn)并鑒定的TFs 有28 種，其中含量最多的是茶黃素（theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF2a）、茶黃素-3′-沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3′-gallate，TF2b）和茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（theaflavin-3，3′-digallate，TF3）4 種單體［7］。眾多研究表明，TFs 具有抗氧化［8］、預(yù)防神經(jīng)退行性疾?。?］、調(diào)節(jié)血糖［10］等多種生物學(xué)活性。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是一種發(fā)育迅速、生命周期短的非寄生線蟲［11］。20 世紀(jì)70年代，Brenner［12］首次將秀麗隱桿線蟲作為一種神經(jīng)科學(xué)模型引入研究，使其成為第一個(gè)擁有完整基因組測(cè)序的多細(xì)胞生物。秀麗隱桿線蟲有60%～80%的基因與人類基因同源，42%的人類疾病基因在秀麗隱桿線蟲基因組中存在清晰的同源物［13］，因此使得秀麗隱桿線蟲作為模式生物在研究藥物篩選和人類疾病機(jī)制等方面成為可能。目前將EGCG 和TFs應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲的研究主要集中在抗衰老［14］、抗氧化應(yīng)激［15］、抗?jié)B透應(yīng)激和紫外應(yīng)激［16］等方面。已有研究表明，EGCG 和富含茶黃素的組分可增加能量消耗、促進(jìn)生熱［17-18］。在低溫條件下秀麗隱桿線蟲通過(guò)TRP 通道延長(zhǎng)壽命，高溫條件下通過(guò)上調(diào)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提供較強(qiáng)的應(yīng)激保護(hù)，進(jìn)而延長(zhǎng)壽命。但是將二者應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲進(jìn)行冷、熱應(yīng)激考察和機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯恳孕沱愲[桿線蟲為生物模型，體外模擬冷、熱環(huán)境溫度，探究綠茶和紅茶中的代表性組分——EGCG和TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲冷、熱應(yīng)激下存活率的影響，進(jìn)一步測(cè)定EGCG 和TF1對(duì)不同溫度條件下秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量和線粒體膜電位水平的影響，對(duì)EGCG 和TF1在不同溫度下發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行了初探，以期為茶多酚生熱研究和秀麗隱桿線蟲耐溫性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N2野生型秀麗隱桿線蟲、大腸桿菌OP50（E.coliOP50），Caenorhabditis Genetics Center（CGC）；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG，≥95%）、牛血清白蛋白（BSA）、TritonTMX-100、膽固醇、蛋白胨、甘油，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；茶黃素（TF1，98%），成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；四甲基羅丹明乙酯（TMRE）、羰基氰基-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），上海源葉生物科技有限公司；?B 培養(yǎng)基，美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；瓊脂（BR 組培級(jí)），北京蘭杰柯科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），AppliChem 公司；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；甘油三酯（TG）測(cè)定測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；鹽酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氫氧化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；S-basal 緩沖液（1.47 g K2HPO4、5.93 g KH2PO4、5.85 g NaCl 溶于1 ?超純水，121 ℃滅菌20 min）。

1.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

提前制備涂布有E.coliOP50 菌液的線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM）平板，每5 d 將成年線蟲轉(zhuǎn)移到平板上，每次挑取4～5 條，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。

1.3 熱、冷應(yīng)激試驗(yàn)

將同步化64 h 后的秀麗隱桿線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有EGCG 和TF1 的NGM 平板上，于20 ℃下孵育5 d，每天使用S-basal 緩沖液收集秀麗隱桿線蟲后轉(zhuǎn)移至新的NGM 平板中以避免產(chǎn)卵帶來(lái)的干擾。熱、冷應(yīng)激試驗(yàn)以DMSO 為空白對(duì)照，每組3 個(gè)平行，每個(gè)平行挑取約20 條線蟲分別置于35、4 ℃溫度條件下培養(yǎng)。熱應(yīng)激試驗(yàn)每小時(shí)計(jì)數(shù)1 次線蟲的死亡情況，直至所有線蟲死亡，試驗(yàn)溫度設(shè)置參考Wilson等［19］。冷應(yīng)激試驗(yàn)每天計(jì)數(shù)線蟲的死亡情況，直至所有線蟲死亡，試驗(yàn)溫度設(shè)置參考?iu等［20］。

1.4 脂肪含量測(cè)定

將同步化64 h 后的秀麗隱桿線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有EGCG 和TF1 的NGM 平板上，于不同溫度（4、20、30 ℃）條件下分別孵育1、5和7 d。用提前冰浴的S-basal 緩沖液收集線蟲，洗滌3 次以除去殘留的菌液，隨后將線蟲轉(zhuǎn)移至2 m?離心管并置于液氮中速凍成顆粒。將線蟲顆粒在液氮預(yù)冷的研缽中與200 μ?5%TritonTMX-100 一起研磨，收集蟲體粉末后置于冰上保存。以30%振幅超聲10 min，隨后在4 ℃條件以12 300 r/min 離心15 min。收集離心后的上清液，使用甘油三酯（TG）測(cè)試盒測(cè)定不同溫度條件下秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂肪含量。同時(shí)，使用BCA 蛋白測(cè)試盒測(cè)定秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。試驗(yàn)結(jié)果以蛋白質(zhì)含量做歸一化處理。

1.5 線粒體膜電位測(cè)定

線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平使用線粒體特異性染料四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE）檢測(cè)。試驗(yàn)以1 μmol/?FCCP 為陽(yáng)性對(duì)照，100 μmol/?TMRE 為熒光染料。試驗(yàn)時(shí)將同步化64 h 后的秀麗隱桿線蟲分別轉(zhuǎn)移到含有EGCG 和TF1 的NGM 平板上，于不同溫度（4、20、30 ℃）條件下孵育1 h、2 h、12 h、24 h、5 d 和7 d。提前制備熱滅活的E.coliOP50 菌液，與100 μ?濃度為100 μmol/?的TMRE檢測(cè)液混合后涂布于NGM 平板上，避光吹干。用S-basal緩沖液分別收集孵育1、2、12、24 h及5 d和7 d的線蟲，轉(zhuǎn)移至含有TMRE 染料的平板上，于20 ℃下孵育2 h。孵育結(jié)束后，用S-basal 緩沖液收集線蟲，轉(zhuǎn)移至含有熱滅活E.coliOP50 菌液的NGM平板上使其自由爬行1 h。最后收集線蟲，以100 μ?/孔將線蟲懸浮液加至黑色96 孔酶標(biāo)板中。熒光強(qiáng)度測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)540 nm、發(fā)射波長(zhǎng)595 nm。測(cè)定完畢后，使用0.01% TritonTMX-100 回收96 孔板中的線蟲，同本文“1.4”步驟中超聲破碎、離心，使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。試驗(yàn)結(jié)果以蛋白質(zhì)含量做歸一化處理。

1.6 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。取超聲破碎、離心后的線蟲上清液，按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒的操作說(shuō)明加樣，37 ℃條件下孵育30 min后于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定吸光值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用GraphpadPrism 7.0 中Survival 進(jìn)行生存分析，分析時(shí)采用?og-rank（Mantel-Cox）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性。使用Origin 2018 軟件作圖，采用IBM SPSS Statistics 25 軟件進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，并采用Duncan’s法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性?！?”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG 和TF1 對(duì)熱應(yīng)激秀麗隱桿線蟲存活率的影響

由圖1可知，經(jīng)EGCG和TF1孵育后，25 μmol/?EGCG處理可顯著提高秀麗隱桿線蟲在35 ℃條件下的存活率。各個(gè)濃度的TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲在熱應(yīng)激下的存活率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。由表1 可知，在35 ℃條件下，經(jīng)25 μmol/?EGCG 孵育后秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別為20.44、11.24 h。與對(duì)照組相比，25 μmol/?EGCG 將秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別提高了8.15%、22.44%。而經(jīng)TF1 孵育后秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命并未增加。表明熱應(yīng)激條件下相同濃度的EGCG對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用強(qiáng)于TF1，特別是當(dāng)孵育濃度為25 μmol/?時(shí)，EGCG 對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用最顯著。

表1 EGCG和TF1孵育后35 ℃熱應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命Table 1 Maximum and median lifespan of C.elegans under heat stress at 35 ℃after incubation with EGCG and TF1

2.2 EGCG 和TF1 對(duì)冷應(yīng)激秀麗隱桿線蟲存活率的影響

如圖2所示，在4 ℃條件下經(jīng)EGCG 和TF1孵育后，中、高濃度TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲具有一定的保護(hù)作用，但效果不顯著。而EGCG 則降低了秀麗隱桿線蟲在冷應(yīng)激狀態(tài)下的存活率，完全喪失了對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用。由表2 可知，在4 ℃條件下，經(jīng)25 μmol/?EGCG 孵育后秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別為17.83、9.97 d。與對(duì)照組相比，25 μmol/?EGCG 將秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別降低了20.25%、17.94%。經(jīng)低濃度TF1孵育后秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別降低了22.36%、16.79%。中濃度TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命無(wú)顯著影響。而經(jīng)高濃度TF1 孵育后秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命分別提高了9.43%、19.01%。冷應(yīng)激條件下相同濃度的TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用強(qiáng)于EGCG，特別是當(dāng)孵育濃度為25 μmol/?時(shí)，TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用最顯著。

表2 EGCG和TF1孵育后4 ℃冷應(yīng)激條件下秀麗隱桿線蟲的最大壽命和中位壽命（線蟲總數(shù)n=60）Table 2 Maximum and median lifespan of C.elegans under cold stress at 4 ℃after incubation with EGCG and TF1（total number of C.elegans，n=60）

2.3 EGCG 和TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲脂肪含量的影響

根據(jù)冷、熱應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)果，選取25 μmol/?的EGCG 和TF1 孵育秀麗隱桿線蟲至不同時(shí)間點(diǎn)后測(cè)定其體內(nèi)脂肪含量。由圖3A 可見(jiàn)，在4 ℃條件下經(jīng)EGCG 和TF1 分別孵育1、5 d 后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著高于對(duì)照組。長(zhǎng)時(shí)間（7 d）孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量與對(duì)照組相比具有升高的趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。圖3B 顯示在正常培養(yǎng)溫度20 ℃下，經(jīng)EGCG 短時(shí)間孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著升高，長(zhǎng)時(shí)間孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著降低。與對(duì)照組相比，TF1 可顯著降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量。由圖3C 可見(jiàn)，在30 ℃條件下經(jīng)EGCG 短時(shí)間（1 d）孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著降低，長(zhǎng)時(shí)間（5 d）孵育后脂肪含量逐漸恢復(fù)，7 d 后與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。經(jīng)TF1 5 d、7 d 長(zhǎng)時(shí)間孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。

2.4 EGCG 和TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平的影響

圖4顯示了在4、20和30 ℃條件下，經(jīng)25 μmol/?EGCG 和TF1 孵育2 h、12 h、24 h、5 d、7 d 后秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位的變化，試驗(yàn)以線粒體解偶聯(lián)劑FCCP 為陽(yáng)性對(duì)照。由圖4A 可見(jiàn)，在4 ℃條件下，TF1 短時(shí)間孵育2 h 后秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平顯著降低，孵育7 d 后線粒體膜電位水平顯著高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，在低溫條件下EGCG 短時(shí)間孵育對(duì)秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平無(wú)顯著影響，長(zhǎng)時(shí)間孵育可提高線粒體膜電位水平。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平大大降低，但EGCG 和TF1 可能對(duì)衰老秀麗隱桿線蟲線粒體活性具有一定的促進(jìn)作用，使得其線粒體膜電位水平高于對(duì)照組。因此，在低溫條件下TF1可能對(duì)年輕成蟲起到了類似線粒體解偶聯(lián)劑的作用，這與冷應(yīng)激狀態(tài)下TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲具有的保護(hù)作用一致。由圖4B 可見(jiàn)，當(dāng)孵育溫度為20 ℃時(shí)，短時(shí)間（2、12 h）孵育后TF1顯著降低了秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平顯著高于對(duì)照組。經(jīng)EGCG 孵育2 h 后秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平顯著降低，長(zhǎng)時(shí)間孵育后，線粒體膜電位水平高于對(duì)照組。在此溫度條件下，EGCG 和TF1均表現(xiàn)出類似線粒體解偶聯(lián)劑的作用，長(zhǎng)時(shí)間孵育均能改善衰老秀麗隱桿線蟲線粒體活性。由圖4C可知，在30 ℃條件下，EGCG 和TF1短時(shí)間孵育12 h后秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平顯著降低。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，秀麗隱桿線蟲死亡數(shù)增加。當(dāng)孵育至24 h 時(shí)，對(duì)照組秀麗隱桿線蟲活力降低，EGCG和TF1 孵育可增加線蟲活力進(jìn)而提高線粒體膜電位水平。與低溫、正常培養(yǎng)溫度條件試驗(yàn)結(jié)果一致，EGCG 和TF1 僅對(duì)年輕成蟲起到了類似線粒體解偶聯(lián)劑的作用。當(dāng)孵育時(shí)間為5、7 d 時(shí)，熱應(yīng)激使秀麗隱桿線蟲大部分死亡，無(wú)法通過(guò)活體秀麗隱桿線蟲檢測(cè)其線粒體膜電位水平。

3 討論

環(huán)境溫度是影響生物體存活率的重要因素之一，較低的環(huán)境溫度可以延長(zhǎng)變溫動(dòng)物的壽命［21］。秀麗隱桿線蟲的正常培養(yǎng)溫度是20 ℃，在此溫度下秀麗隱桿線蟲的平均壽命為20 d 左右。較高的環(huán)境溫度會(huì)大大降低秀麗隱桿線蟲的存活率，而低溫下秀麗隱桿線蟲具有更長(zhǎng)的壽命［22］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫（35 ℃）條件下EGCG 對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用顯著強(qiáng)于TF1，低溫（4 ℃）條件下TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用強(qiáng)于EGCG。已有研究表明，0.1 μg/m?EGCG 具有抗熱應(yīng)激的能力，可將35 ℃條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命提高13.1%［15］。Xiong 等［16］發(fā)現(xiàn)紅茶提取物可延長(zhǎng)熱應(yīng)激秀麗隱桿線蟲的壽命。本研究通過(guò)測(cè)定不同濃度EGCG 以及TF1 對(duì)秀麗隱桿線蟲在冷、熱應(yīng)激條件下存活率的影響發(fā)現(xiàn)，25 μmol/?EGCG 顯著提高了熱應(yīng)激秀麗隱桿線蟲的存活率，25 μmol/?TF1對(duì)熱應(yīng)激秀麗隱桿線蟲的存活率無(wú)顯著影響。25 μmol/?EGCG 降低了秀麗隱桿線蟲在冷應(yīng)激條件下的存活率，而25 μmol/?TF1 對(duì)冷應(yīng)激秀麗隱桿線蟲具有一定的保護(hù)作用。

為進(jìn)一步驗(yàn)證EGCG 及TF1 對(duì)熱、冷應(yīng)激秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用差異，本研究測(cè)定了不同溫度條件下EGCG 和TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲脂肪含量和線粒體膜電位水平的影響。有文獻(xiàn)報(bào)道，冷應(yīng)激可激活PKA 信號(hào)進(jìn)而上調(diào)激素敏感脂肪酶hosl-1 的表達(dá)，脂肪酶誘導(dǎo)脂肪動(dòng)員，導(dǎo)致甘油積累，從而保護(hù)秀麗隱桿線蟲免受冷應(yīng)激傷害［20］。本研究中，低溫（4 ℃）條件下經(jīng)EGCG 和TF1 短時(shí)間孵育后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著高于對(duì)照組，這一現(xiàn)象說(shuō)明EGCG 和TF1通過(guò)某種機(jī)制補(bǔ)償了脂肪分解產(chǎn)生甘油為秀麗隱桿線蟲成蟲早期提供的保護(hù)作用。Zhou 等［23］發(fā)現(xiàn)高溫培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲提高了其體內(nèi)的總脂肪含量。而本研究結(jié)果顯示高溫（30 ℃）條件下EGCG 和TF1短時(shí)間孵育會(huì)降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂肪含量，但經(jīng)EGCG 孵育5 d、TF1 孵育7 d后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量升高。作為綠茶和紅茶中的代表性組分，EGCG 和TF1 的生物學(xué)活性已被廣泛研究。例如，膳食中添加富含EGCG 的綠茶提取物（10 mg/m?EGCG）會(huì)影響果蠅的葡萄糖代謝，促進(jìn)健康和延長(zhǎng)壽命［24］；在健康小鼠模型中，模擬人類喝茶的方式每天喂食25 mg/kg EGCG可以使其中位壽命延長(zhǎng)13.5%［25］。動(dòng)物試驗(yàn)和人體試驗(yàn)結(jié)果均表明，TF1 可有效預(yù)防肥胖、減少甘油三酯的積累［26-27］。與先前報(bào)道的EGCG 和TF1具有降脂作用一致，本研究以秀麗隱桿線蟲為模型，通過(guò)測(cè)定正常培養(yǎng)溫度（20 ℃）條件下EGCG和TF1對(duì)其脂肪含量的影響發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG 和TF1 長(zhǎng)時(shí)間（5、7 d）孵育后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂肪含量顯著降低。綜上所述，在20 ℃條件下EGCG 和TF1 均表現(xiàn)出顯著的降脂作用，低溫條件下可能通過(guò)某種機(jī)制對(duì)秀麗隱桿線蟲成蟲早期發(fā)揮保護(hù)作用進(jìn)而減少了脂肪動(dòng)員，高溫條件下可提高脂肪含量。

線粒體功能與人體穩(wěn)態(tài)息息相關(guān)，人類許多疾病的發(fā)生和發(fā)展均與線粒體功能紊亂相關(guān)，因此，研究外源性物質(zhì)對(duì)其功能的影響尤為重要。研究表明，黃酮類化合物作為質(zhì)子載體，通過(guò)線粒體解偶聯(lián)消散線粒體膜電位誘導(dǎo)線粒體自噬，從而減輕與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性變［28］。FCCP 是一種線粒體解偶聯(lián)劑，常作為線粒體膜電位試驗(yàn)中的陽(yáng)性對(duì)照。它作用于線粒體內(nèi)膜使大量質(zhì)子回流，從而導(dǎo)致線粒體膜電位降低、氧耗增加，跨膜產(chǎn)生的勢(shì)能以熱能的形式散失而導(dǎo)致ATP 生成減少［29］。為進(jìn)一步探究TF1 是否可作為質(zhì)子載體起到類似解偶聯(lián)劑的作用，本研究還測(cè)定了不同溫度條件下EGCG 和TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲膜電位的影響。結(jié)果顯示，在低溫條件下，TF1 短時(shí)間孵育2 h 可顯著降低秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平，而EGCG 對(duì)秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位水平無(wú)顯著影響。這一結(jié)果說(shuō)明TF1 可能起到類似解偶聯(lián)劑FCCP的作用，通過(guò)降低線粒體膜電位，進(jìn)而增加熱能產(chǎn)生從而提高冷應(yīng)激線蟲的存活率。本研究中線粒體膜電位試驗(yàn)使用的TMRE是一種可滲透細(xì)胞膜的橘紅色陽(yáng)離子熒光探針，可在完整的線粒體中聚集，而去極化或非活躍性線粒體膜電位降低，導(dǎo)致TMRE積聚減少。有文獻(xiàn)報(bào)道，由于線粒體中TMRE 的積累依賴于線粒體活性，經(jīng)TMRE 染色之后，老年線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度降低［28］。本研究結(jié)果與其一致，長(zhǎng)時(shí)間孵育后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度降低，但經(jīng)EGCG 和TF1 孵育后衰老線蟲體內(nèi)的熒光強(qiáng)度提高，說(shuō)明EGCG 和TF1 可提高衰老線蟲的活力。

綜上，在35 ℃熱應(yīng)激條件下，EGCG 對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用強(qiáng)于TF1；在4 ℃冷應(yīng)激條件下，TF1對(duì)秀麗隱桿線蟲的保護(hù)作用強(qiáng)于EGCG。在冷、熱應(yīng)激條件下，當(dāng)孵育濃度為25 μmol/?時(shí)二者對(duì)比最顯著。與對(duì)照組相比，4 ℃條件下經(jīng)25 μmol/?TF1 短時(shí)間孵育后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)具有更高的脂肪含量和更低的線粒體膜電位，而25 μmol/?EGCG 對(duì)秀麗隱桿線蟲線粒體膜電位無(wú)顯著影響，說(shuō)明在冷應(yīng)激條件下TF1 可能是通過(guò)發(fā)揮類似線粒體解偶聯(lián)劑的作用而非脂肪動(dòng)員，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體生熱從而減輕冷應(yīng)激對(duì)秀麗隱桿線蟲造成的傷害。正常溫度條件下EGCG 和TF1均具有較好的降脂作用。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，衰老秀麗隱桿線蟲行為遲鈍、生理功能下降，而EGCG 和TF1可減輕衰老對(duì)其造成的不利影響，改善其線粒體功能。