郝 蘊(yùn)，吳瓏婕，韓 培，王 佳，田詠梅

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室 鄭州 450001 2)電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院(四川省人民醫(yī)院)臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 成都 610072

有機(jī)磷阻燃劑(organophosphate flame retardants，OPFR)是近年來(lái)使用較多的阻燃劑，廣泛應(yīng)用于塑料、建材、紡織品、家具等各種工業(yè)生產(chǎn)中[1]。常見(jiàn)的22種OPFR可根據(jù)取代基的不同分為3大類(lèi)：氯代烷基磷酸酯類(lèi)(Cl-OPFR)、烷基磷酸酯類(lèi)(Alkyl-OPFR)和芳基磷酸酯類(lèi)(Aryl-OPFR)；多數(shù)OPFR具有急性毒性，具體毒性表現(xiàn)為生殖與發(fā)育毒性、基因毒性與致突變性、內(nèi)分泌干擾性等[2]。此外，Cl-OPFR還有一定的神經(jīng)毒性、臟器毒性[3]。人體同時(shí)暴露于多種OPFR，室內(nèi)灰塵吸入是其進(jìn)入人體的主要方式[2]。這些OPFR具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其聯(lián)合效應(yīng)可能呈現(xiàn)加和甚至協(xié)同效應(yīng)[4]。但是，目前對(duì)其聯(lián)合毒性的研究多集中在OPFR與其他環(huán)境毒物的聯(lián)合，如與傳統(tǒng)有機(jī)毒物[5]、重金屬[6]、新興污染物[7]聯(lián)合等，而忽略了OPFR之間的聯(lián)合效應(yīng)。Chou和Talalay定義的聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)法通過(guò)質(zhì)量守恒定律中的中位效應(yīng)方程，將藥物之間以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)之間建立聯(lián)系，能夠定性和定量描述聯(lián)合作用[8]?！癈ompuSyn”是針對(duì)CI法開(kāi)發(fā)的研究藥物聯(lián)合作用的量-效分析軟件，可繪制細(xì)胞存活率-聯(lián)合指數(shù)(Fa-CI)圖，觀察聯(lián)合作用類(lèi)型和強(qiáng)度隨濃度變化的情況[9]。因此，本研究選擇中國(guó)室內(nèi)灰塵中檢出占比較高的3種OPFR[10]，采用等價(jià)效應(yīng)劑量比[11][即以化合物單獨(dú)作用時(shí)的半數(shù)抑制濃度(IC50)之比為混合比]，將3種OPFR隨機(jī)組合成二元或三元混合物，采用CI法探討3種OPFR的聯(lián)合效應(yīng)，為評(píng)估OPFR的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材磷酸三(2-正丁氧乙基)酯[Tris(2-butoxyethyl) phosphate，TBOEP；CAS：78-51-3]購(gòu)自阿拉丁公司，磷酸三(2-氯丙基)酯[Tris(1-chloro-2-propyl) phosphate，TCIPP；CAS：13674-84-5]、磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯[Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate，TDCIPP；CAS：13674-87-8]購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，3種化學(xué)品的純度均>96%。CCK-8試劑盒(美國(guó)Targetmol公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(以色列Biological Industries公司)，二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ELx808酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)永生化人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)箱(37 ℃、95%濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2)中培養(yǎng)。每2 d進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。

1.3 3種OPFR培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞后細(xì)胞活力的CCK-8法檢測(cè)3種OPFR溶解于DMSO中，制備成母液，用培養(yǎng)基稀釋至少6個(gè)濃度梯度。BEAS-2B細(xì)胞以5 000個(gè)/孔的密度加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育14 h后，分別暴露于不同劑量的OPFR(每種OPFR單獨(dú)或二元和三元混合)中48 h，加入CCK-8試劑孵育3 h，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每組的吸光度(A)，依據(jù)公式：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As：實(shí)驗(yàn)孔吸光度；Ac：對(duì)照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度)計(jì)算細(xì)胞存活率。每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)平行樣。

1.4 3種OPFR二元或三元混合培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞的聯(lián)合效應(yīng)分析CI的計(jì)算公式如下：

其中：D為單用劑量，Dx為聯(lián)用劑量。CI>1為拮抗作用，CI=1為相加作用，CI<1為協(xié)同作用，CI<0.7則協(xié)同作用較強(qiáng)[9]。

采用等效線圖定性判斷OPFR二元混合物對(duì)細(xì)胞的聯(lián)合效應(yīng)。等效線圖的x軸和y軸分別為構(gòu)成二元混合物的組分A和組分B的劑量單位，在無(wú)相互作用的情況下，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)將形成一條筆直的線，即加和線。若實(shí)驗(yàn)點(diǎn)落于加和線上方和下方，分別為拮抗和協(xié)同作用[12]。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 9對(duì)單個(gè)化合物及混合物的劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行非線性擬合，采用CompuSyn對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合效應(yīng)分析。

2 結(jié)果

2.1 3種OPFR單獨(dú)和聯(lián)合作用于細(xì)胞的毒性效應(yīng)見(jiàn)圖1。由圖1A可知，3種OPFR的非線性回歸擬合的濃度-反應(yīng)曲線(concentration-response curve,CRC)的決定系數(shù)(R2)均高于96%，擬合效果較好。對(duì)BEAS-2B細(xì)胞毒性的大小依次為T(mén)DCIPP>TBOEP>TCIPP，其IC50分別為85.8、204.9、758.8 μmol/L。本研究將3種OPFR以等價(jià)效應(yīng)(IC50)劑量比分別進(jìn)行二元和三元混合?；旌衔锏腃RC見(jiàn)圖1B，由圖1B可知，4種混合物在低劑量濃度下細(xì)胞存活率的實(shí)測(cè)值均低于擬合的CRC，說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)，混合物的毒性增強(qiáng)。

A：OPFR的單獨(dú)細(xì)胞毒性效應(yīng)；B：OPFR的聯(lián)合細(xì)胞毒性效應(yīng)(BD、BC、DC、BDC分別為T(mén)BOEP+TDCIPP、TBOEP+TCIPP、TDCIPP+TCIPP、TBOEP+TDCIPP+TCIPP的混合物組)

2.2 聯(lián)合作用分析結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2A可知，F(xiàn)a-CI圖以不同顏色的平滑曲線展示4種混合物的CI值隨細(xì)胞存活率(Fa)變化的情況。隨著Fa的升高，CI值降低，在Fa高于50%(即在混合物濃度低于IC50的范圍內(nèi))，4種混合物的CI值及其95%置信區(qū)間均小于1，說(shuō)明混合物的各組分間的聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同作用(即3種OPFR的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用)；且隨著混合物效應(yīng)濃度的降低，協(xié)同作用具有增強(qiáng)的趨勢(shì)。將IC50及以下的幾個(gè)具體的效應(yīng)點(diǎn)上的CI值以條形圖(圖2B)展示，混合物在Fa為97%、95%、90%的效應(yīng)點(diǎn)上有較強(qiáng)的協(xié)同作用。在此3個(gè)效應(yīng)濃度下做二元混合物的等效線圖，如圖3所示，TBOEP和TDCIPP、TDCIPP和TCIPP、TBOEP和TCIPP的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均落于對(duì)應(yīng)的加和線下方，可判定為協(xié)同作用。等效線法和CI法的結(jié)果相同，說(shuō)明CI法的適用性和準(zhǔn)確性較好。

A：CI隨Fa變化的趨勢(shì)圖；B：不同效應(yīng)濃度下的CI值

圖3 OPFR二元混合物聯(lián)合毒性的等效線圖

3 討論

OPFR是多溴聯(lián)苯醚等傳統(tǒng)阻燃劑的替代品，因具有低煙、低毒、低鹵、低成本和良好的阻燃效果而被廣泛應(yīng)用。但OPFR為添加型阻燃劑，其通過(guò)物理混合而不是化學(xué)反應(yīng)的方式添加到聚合材料中，易通過(guò)揮發(fā)、浸出、磨損和溶解等方式釋放到周?chē)h(huán)境中[13]。目前，已在灰塵、室內(nèi)外空氣、水體、沉積物和土壤及生物體內(nèi)檢出多種OPFR[4,14-15]。其分布特點(diǎn)是：室內(nèi)環(huán)境中的OPFR水平較高(室內(nèi)灰塵中的OPFR水平平均可達(dá)8.81 μg/g)，可能與裝修材料的緩慢釋放有關(guān)[10]；灰塵中的OPFR水平遠(yuǎn)高于空氣中，可能與大氣壓和OPFR的理化性質(zhì)有關(guān)[3]。人體主要通過(guò)灰塵吸入OPFR[2]，進(jìn)入體內(nèi)的OPFR通過(guò)肝臟代謝，在細(xì)胞色素P450、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等的催化下，經(jīng)水解、脫氯、與葡萄糖醛酸、谷胱甘肽結(jié)合等代謝反應(yīng)，最終被降解為磷酸二酯或磷酸三酯。非Cl-OPFR的代謝速率高于Cl-OPFR。OPFR具體的代謝通路和代謝產(chǎn)物還有待深入研究[3]。

本研究選取了中國(guó)室內(nèi)灰塵中檢出占比較高的3種OPFR，探討其對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的單獨(dú)和聯(lián)合毒性作用，為人體呼吸道暴露OPFR的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCIPP對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的毒性作用遠(yuǎn)低于TBOEP、TDCIPP，可能對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響較小。3種OPFR的IC50與其他文獻(xiàn)報(bào)道略有不同，如：TBOEP對(duì)鼠肝細(xì)胞系H4IIE的IC50為170.9 μmol/L[16]，而對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2的IC50為1 000 μmol/L[17]；TDCIPP 對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的IC50為100 μmol/L[18]；400 μmol/L的TCIPP造成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞20.56%的抑制率[19]等。造成IC50浮動(dòng)的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)條件的不同或采用的細(xì)胞系不同，提示不同細(xì)胞系可能對(duì)OPFR毒性作用的敏感性不同。

有研究[20]報(bào)道OPFR是室內(nèi)污染的重要來(lái)源，人群正在長(zhǎng)期、微量地接觸多種OPFR。本研究將3種OPFR隨機(jī)組合成4種混合物，對(duì)其進(jìn)行聯(lián)合作用分析，F(xiàn)a-CI圖及條形圖顯示，在低于IC50范圍內(nèi)，混合物的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，且隨著濃度降低，協(xié)同作用增強(qiáng)。表明3種OPFR在低劑量的情況下，更可能發(fā)揮協(xié)同的作用，使其組成的混合物的毒性增強(qiáng)?？紤]到人群實(shí)際的暴露環(huán)境，OPFR這一聯(lián)合作用特點(diǎn)，可能給人群帶來(lái)更大的健康風(fēng)險(xiǎn)。

目前，有多種方法研究多個(gè)化合物的聯(lián)合作用。傳統(tǒng)的研究聯(lián)合效應(yīng)的方法是先建立數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)混合物的毒性，再將預(yù)測(cè)的毒性與實(shí)驗(yàn)觀察到的毒性比較，根據(jù)實(shí)際毒性偏離預(yù)測(cè)毒性的程度，判斷聯(lián)合作用的類(lèi)型。在此理論的基礎(chǔ)上，引入了特定效應(yīng)點(diǎn)(IC50)上的指標(biāo)判定法，如：危害指數(shù)法、毒性單位法等。根據(jù)混合物的各組分是否引起相同的生物響應(yīng)，經(jīng)典的預(yù)測(cè)模型分為濃度加和模型和效應(yīng)加和模型，因此，預(yù)測(cè)混合物毒性需要對(duì)各組分的毒性作用機(jī)制有一定的了解[11]。此外，還可通過(guò)特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(如析因設(shè)計(jì))定性判斷各組分間是否有相互作用[21]，如有關(guān)雙酚a、壬基酚和己烯雌酚在基準(zhǔn)劑量水平下的聯(lián)合雌性效應(yīng)的研究[22]。但析因設(shè)計(jì)只能定性判斷聯(lián)合作用，且往往只設(shè)置2～3個(gè)濃度水平，無(wú)法探討聯(lián)合作用類(lèi)型隨混合物濃度變化的情況，所得信息有限。

OPFR是新興的環(huán)境污染物，對(duì)其毒性的作用機(jī)制尚有很多未知。本研究所選擇的CI法是基于化合物相互作用的一般物理化學(xué)規(guī)律而建立的模型，避免了因選擇預(yù)測(cè)模型不當(dāng)而造成的偏倚，CI法不僅能定性判斷聯(lián)合作用的類(lèi)型，在一定程度上量化聯(lián)合作用的強(qiáng)度，還可根據(jù)Fa-CI圖，在整個(gè)效應(yīng)區(qū)間上觀察聯(lián)合作用類(lèi)型隨濃度變化的情況，提供了OPFR更多聯(lián)合效應(yīng)方面的信息。

本研究結(jié)果表明，在4種組合方式中，TBOEP和TDCIPP、TBOEP和TCIPP組合的協(xié)同作用較強(qiáng)。TCIPP、TDCIPP為氯基取代的OPFR，可與烷基取代的OPFR TBOEP產(chǎn)生更強(qiáng)的協(xié)同作用，提示氯基和烷基取代的OPFR可能在發(fā)揮毒性的作用機(jī)制上有相似的代謝通路，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的協(xié)同作用，后續(xù)需要更深入的研究，以探討氯基和烷基取代的OPFR產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制。此外，雖然3種OPFR的聯(lián)合效應(yīng)均表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，但其構(gòu)成的三元混合物BCD卻未表現(xiàn)出更強(qiáng)的混合毒性，可能是因?yàn)榈葍r(jià)效應(yīng)比混合的BCD的主要成分為T(mén)CIPP，其聯(lián)合作用的表現(xiàn)接近于TCIPP和TBOEP、TCIPP和TDCIPP的聯(lián)合效應(yīng)。

一項(xiàng)對(duì)13種有機(jī)污染物的二元聯(lián)合作用類(lèi)型的研究[23]發(fā)現(xiàn)，TDCIPP和另一種常用的OPFR(磷酸三苯酯)具有協(xié)同毒性作用。本次研究也發(fā)現(xiàn)了TDCIPP和TBOEP、TCIPP存在協(xié)同作用，提示在常用的二十多種OPFR中[2]，可能有較多的組合具有協(xié)同作用。因此，應(yīng)納入更多種類(lèi)的OPFR，研究其協(xié)同作用是否普遍發(fā)生。

總之，本研究結(jié)果提示TBOEP與TCIPP、TDCIPP具有協(xié)同作用，且在低濃度范圍內(nèi)協(xié)同作用更強(qiáng)。在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，應(yīng)充分考慮不同OPFR間的協(xié)同作用，從而避免低估風(fēng)險(xiǎn)。