包綺晗,李承圣,王浩樺,丁子琛,周立雯,叢慧文,王廉源,楊 毅,石福艷,潘慶忠,王素珍

1)濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系 山東濰坊 261053 2)濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院數(shù)學(xué)教研室 山東濰坊 261053

我國2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患病人數(shù)全球第一，且有患者逐漸年輕化的趨勢(shì)，T2DM的早期預(yù)防極為重要。肥胖被認(rèn)為是糖尿病、高血壓等慢性病的主要危險(xiǎn)因素[1]。賀媛等[2]研究發(fā)現(xiàn)，BMI每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.7倍；蘇健等[3]的研究得出類似結(jié)論，BMI最高分位組(>25.89 kg/m2)糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)是最低分位組(<21.70 kg/m2)的3.09倍。WHO 2016年全球衛(wèi)生觀察站報(bào)告顯示，我國成年人口BMI超過30 kg/m2的標(biāo)化率已增至6.4%[4-5]，美國、法國、英國、德國、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家分別為36.2%、21.6%、27.8%、22.3%、29.0%；雖然上述五國肥胖率遠(yuǎn)高于我國，但僅有美國糖尿病患病率與我國相近，其余國家均低于5%[6-7]。

在傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究中，暴露與結(jié)局的關(guān)聯(lián)可能受到未測(cè)量混雜和反向因果的影響，從而導(dǎo)致因果關(guān)系推斷時(shí)受限。孟德爾隨機(jī)化(Mendelian randomization，MR)法近年來廣泛用于全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)數(shù)據(jù)的因果關(guān)系研究中。MR法是利用遺傳變異配子形成過程中隨機(jī)分裂與組合的特性對(duì)人群重新隨機(jī)分組，這在理論上避免了混雜因素的影響，同時(shí)以遺傳變異(暴露的工具變量)所解釋的變異也優(yōu)先結(jié)局所解釋的變異，由此排除了逆向因果問題[8-10]。本研究采用兩樣本MR法,以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為工具變量,基于GWAS匯總數(shù)據(jù)，從基因?qū)用娣治鯞MI與T2DM的因果關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源通過IEU OpenGWAS project(mrcieu.ac.uk)網(wǎng)站獲得近3 a的、樣本量最大的BMI(ieu-b-40)及T2DM(ebi-a-GCST006867)的GWAS數(shù)據(jù)。網(wǎng)站訪問時(shí)間為2021-08-15。最終兩組數(shù)據(jù)的人群來源均為歐洲，男女不限。BMI數(shù)據(jù)集樣本量為681 275，SNP數(shù)量為2 336 260；T2DM數(shù)據(jù)集樣本量為655 666，SNP數(shù)量為5 030 727。

1.2 SNP作為工具變量的條件設(shè)定①工具變量與暴露高度相關(guān)，以F>10為強(qiáng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。 ②工具變量不與結(jié)局直接相關(guān)，僅通過暴露影響結(jié)局，即不存在基因多效性。本研究以MR-Egger回歸模型的截距項(xiàng)非0(P<0.05)表示不存在基因多效性[13-14]。 ③工具變量與未測(cè)混雜無關(guān)。由于MR方法選擇的SNP遵循親代等位基因隨機(jī)分配給子代的遺傳原則，受到的環(huán)境和后天生活的作用很小，即理論上可認(rèn)為工具變量與社會(huì)經(jīng)濟(jì)文化等環(huán)境因素是相互獨(dú)立的[15]。

1.3 SNP篩選從BMI的GWAS匯總數(shù)據(jù)中篩選出有意義的SNP(以P<5×10-8為篩選條件)；設(shè)定連鎖不平衡系數(shù)r2為0.001，連鎖不平衡區(qū)域?qū)挾葹?0 000 kb，以保證各個(gè)SNP相互獨(dú)立，排除基因多效性對(duì)結(jié)果的影響[16-17]。從T2DM的GWAS匯總數(shù)據(jù)中提取上述篩選出的BMI相關(guān)SNP；設(shè)定最小r2>0.8，缺失的SNP用與其具有高度連鎖性的SNP代替，刪除無替代位點(diǎn)的SNP[15]。匯總上述兩個(gè)數(shù)據(jù)集的信息，同時(shí)剔除與T2DM直接相關(guān)的SNP(P<5×10-8)[18]。

1.4 因果關(guān)系驗(yàn)證方法采用MR-Egger回歸、加權(quán)中位數(shù)法(weight median estimator,WME)、隨機(jī)效應(yīng)逆方差加權(quán)法(inverse-variance weighted,IVW)、加權(quán)模型4種回歸模型，以SNP為工具變量，驗(yàn)證暴露(BMI)與結(jié)局(T2DM)的因果關(guān)系。其中，IVW法不需要個(gè)體層面數(shù)據(jù)，可使用匯總數(shù)據(jù)直接計(jì)算因果效應(yīng)值。MR-Egger回歸通過計(jì)算每個(gè)SNP與T2DM的相關(guān)性(Y)及SNP與BMI的相關(guān)性(X)，然后擬合線性函數(shù)。WME法計(jì)算第j個(gè)SNP所對(duì)應(yīng)的暴露-結(jié)局的因果效應(yīng)估計(jì)值(βj)。應(yīng)用Cochran's Q檢驗(yàn)判斷SNP的異質(zhì)性[19]；若存在異質(zhì)性，則關(guān)注IVW模型結(jié)果；采用Leave-one-out方法進(jìn)行敏感性分析。上述方法均使用R 4.0.4軟件中的TwoSampleMR包實(shí)現(xiàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 篩選出的SNP信息經(jīng)過幾次篩選，T2DM數(shù)據(jù)集獲得465個(gè)SNP，交集情況見圖1，經(jīng)初步敏感性分析后剔除一個(gè)離群，同時(shí)排除13個(gè)模棱兩可的SNP，最終納入451個(gè)SNP,部分SNP基本信息見表1。MR-Egger回歸截距項(xiàng)為0.000 3(P=0.826 1)，提示篩選出的SNP與T2DM不存在基因多效性。

圖1 暴露與結(jié)局SNP數(shù)據(jù)交集

表1 最終篩選出的部分SNP的信息

2.2 因果關(guān)系驗(yàn)證4種方法的回歸結(jié)果見表2，均顯示BMI為T2DM患病的危險(xiǎn)因素,BMI每增加1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)約增加2.9倍。

2.3 異質(zhì)性檢驗(yàn)散點(diǎn)圖和漏斗圖見圖2。漏斗圖顯示納入的所有SNP基本對(duì)稱，但MR-Egger回歸結(jié)果顯示統(tǒng)計(jì)量Q=1 289.365(P<0.001)，提示SNP間存在異質(zhì)性，故關(guān)注隨機(jī)效應(yīng)IVW模型。

圖2 孟德爾隨機(jī)化散點(diǎn)圖(左)和漏斗圖(右)

2.4 敏感性分析經(jīng)Leave-one-out檢驗(yàn)，依次剔除各SNP，余下的450個(gè)SNP的β值在1.028～1.055(P<0.001)；去除任何一個(gè)SNP后，余下450個(gè)SNP的結(jié)果都在無效線的右側(cè)，并且都與總效應(yīng)的區(qū)間相近；說明無論去除任意一個(gè)SNP都不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響，表明本研究的MR結(jié)果是穩(wěn)健的。

3 討論

既往賀媛等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，在中國全人群中T2DM患病率隨BMI的上升而增加，在BMI由正常升至2級(jí)肥胖后T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)增加了5.9倍。劉俊等[20]一項(xiàng)包含美國45歲以上女性、伊朗和澳大利亞20歲以上全人群、芬蘭25歲以上全人群及歐洲中年白人的meta分析結(jié)果也表明，超重者T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)是體重正常者的2.59倍，而肥胖者是體重正常者的6.28倍。王超等[21]發(fā)現(xiàn)在超重和肥胖的中國人群中，肥胖人群患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)比超重人群顯著增加。Marie-Eve等[23]綜述研究結(jié)果也表明，丹麥人群和挪威20～61歲人群中肥胖、腰圍、腰臀比和BMI等肥胖指標(biāo)的增加等能夠促進(jìn)T2DM相關(guān)指標(biāo)的增加。Abuyassin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯人BMI的增加是T2DM發(fā)病的危險(xiǎn)因素。Mokdad等[25]的研究表明，BMI處于30～35的美國男性T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)是BMI正常男性的10倍，而女性則達(dá)20倍。但是也有少數(shù)研究結(jié)果顯示BMI與T2DM無關(guān)，比如張銳芝等[22]發(fā)現(xiàn)中國60歲以上老年人BMI與T2DM的優(yōu)勢(shì)比OR為0.992，但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.761)。

我國肥胖人群比發(fā)達(dá)國家少，但T2DM患者卻比發(fā)達(dá)國家多，說明BMI是T2DM的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素但可能不是必須因素或最主要因素，而是多種因素共同作用的結(jié)果。本研究基于GWAS匯總數(shù)據(jù)，以BMI高度相關(guān)的SNP為工具變量，使用兩樣本MR法探索BMI與T2DM的因果關(guān)系,結(jié)果顯示：BMI是T2DM患病的危險(xiǎn)因素；隨機(jī)效應(yīng)模型IVW結(jié)果表明，BMI每增加一個(gè)單位，人群T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.842倍；提示預(yù)防T2DM應(yīng)更關(guān)注通過飲食和生活習(xí)慣的調(diào)整，控制體重和BMI。

本研究以歐洲人群為例，驗(yàn)證了MR方法應(yīng)用于慢性病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究的可行性。探索中國人與歐洲人T2DM相關(guān)遺傳位點(diǎn)的差異，從微觀層面尋找可預(yù)防的符合我國人群特征的T2DM關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，對(duì)我國T2DM早期預(yù)防也有指導(dǎo)意義。但是，目前亞洲和中國人群GWAS數(shù)據(jù)較少，而其他數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)又難以獲取和整理，所以本研究結(jié)果還需結(jié)合臨床和隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)在中國人群中進(jìn)行驗(yàn)證。