郝淼淼,田海燕,劉 晗,王義精,高莉娜,滕軍放

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以磷酸化Tau(pTau)蛋白異常聚集為主要病理表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病[1],但其病理機(jī)制不明。既往研究[2-5]在多種疾病模型(創(chuàng)傷性腦損傷模型、帕金森病模型等)中發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)淀粉樣蛋白的異常聚集可能與大腦內(nèi)類淋巴系統(tǒng)清除功能障礙有關(guān)。類淋巴系統(tǒng)依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞足突末端水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)，參與腦脊液的引流和腦組織內(nèi)異常蛋白和代謝廢物的清除[6-9]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)AD患者大腦皮層血管周圍AQP4表達(dá)減少,但AQP4低表達(dá)對(duì)AD的pTau蛋白形成和聚集的作用機(jī)制尚未闡明。作者構(gòu)建AQP4+/-和C57小鼠AD模型，評(píng)估大腦皮層pTau蛋白和AQP4的表達(dá)對(duì)小鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)pTau蛋白聚集及星形膠質(zhì)細(xì)胞變化的影響，探究AQP4低表達(dá)促進(jìn)AD模型小鼠大腦內(nèi)pTau蛋白形成聚集的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器鼠源性Tau蛋白單體購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，多聚甲醛固定液購(gòu)自北京索萊寶有限公司，蔗糖甲醛溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，鼠抗pTau抗體、雞抗GFAP抗體和山羊抗雞IgY購(gòu)自Abcam公司，兔抗AQP4抗體購(gòu)自Sigma公司，山羊血清封閉液購(gòu)自博士德公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG購(gòu)自Cell signaling公司，Cy5結(jié)合驢抗鼠抗體、Cy5結(jié)合驢抗兔抗體購(gòu)自Jackson Immunology公司，Hoechst33258購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，伊文思藍(lán)(Evan blue,EB)染色液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。鼠源性Tau蛋白纖維體制備：將鼠源性Tau蛋白單體以1 g/L的濃度溶于緩沖液(Tris/PBS,60 g/L巖藻糖，pH 8.0)后，置2 mL EP管內(nèi)密封，利用磁力攪拌機(jī)在37 ℃ 1 000 r/min的條件下攪拌7 d，用超聲破碎機(jī)振蕩45 s，將制備好的1 g/L的Tau蛋白纖維體凍存于-80 ℃冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組30只健康雄性C57BL/6J(C57)小鼠，6～8周，體重18～22 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，30只健康雄性AQP4+/-小鼠(在C57小鼠背景下靶向敲除部分AQP4基因產(chǎn)生，子代通過PCR技術(shù)進(jìn)行基因分型，其所用引物為5’-CAGAGACACAGCGGGTAGAC-3’和 5’-TGTTCTAT TGTTGCTAAGAAGGC-3’)，6～8周，體重17～20 g，購(gòu)自上海南方模式生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)分組：注射2.5 μL濃度為1 g/L的鼠源性Tau蛋白纖維體(制備方法見1.1)的15只C57小鼠和15只AQP4+/-小鼠為C57 Tau組和AQP4+/-Tau組。注射等體積PBS的10只C57小鼠和10只AQP4+/-小鼠為C57 PBS組和 AQP4+/-PBS組。5只C57小鼠和5只AQP4+/-小鼠用于類淋巴系統(tǒng)示蹤檢測(cè)。

1.3 構(gòu)建AD模型將小鼠用異氟烷麻醉后，將濃度為1 g/L的鼠源性Tau纖維體2.5 μL緩慢注入小鼠前額葉皮層，以前囟為標(biāo)志，注射坐標(biāo)定位為前囟+0.8 mm,旁開+3.3 mm,深度-3 mm。注射完畢后留針3 min，緩慢拔出針頭后無液體滲出，縫皮消毒，待小鼠清醒后狀態(tài)良好，即模型構(gòu)建成功[4]。對(duì)照組則分別在C57小鼠和AQP4+/-小鼠相同部位注射等體積的PBS緩沖液。

1.4 EB示蹤C(jī)57和AQP4+/-小鼠大腦類淋巴系統(tǒng)小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，向其小腦延髓池緩慢注射0.05 kg/L的EB溶液3 μL。將小鼠頭部固定于立體定位儀上消毒，用剪刀剪開頭部皮膚，暴露顱骨三角區(qū)，微量注射器緩慢注射EB于小腦延髓池，注射完成30 min后，經(jīng)心臟灌注處死小鼠后取腦組織，10 μm厚冰凍切片，切片置于熒光顯微鏡下，觀察小鼠大腦內(nèi)示蹤劑EB溶液在大腦內(nèi)沿類淋巴系統(tǒng)引流分布情況，利用Image J半定量分析腦切片EB的殘余熒光面積。

1.5 小鼠大腦內(nèi)pTau蛋白表達(dá)的檢測(cè)注射鼠源性Tau蛋白2個(gè)月后，將4組小鼠安樂死，取腦組織于多聚甲醛固定液中固定24 h，石蠟包埋,4 μm厚切片。腦切片經(jīng)二甲苯脫蠟，濃度梯度的乙醇脫水，去離子水去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，置于檸檬酸鈉中行高溫高壓以修復(fù)抗原，修復(fù)后用山羊血清封閉30 min,一抗(pTau抗體,按1∶300稀釋)4 ℃孵育過夜，室溫復(fù)溫1 h，PBS清洗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗鼠IgG，按1∶500稀釋)室溫孵育40 min。DAB顯色，樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠大腦皮層、紋狀體。大腦皮層或紋狀體以棕色顆粒樣著色為陽(yáng)性染色，以同一層面上pTau陽(yáng)性染色面積占該層面總面積的百分比計(jì)算pTau蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。

1.6 小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、AQP4和pTau蛋白的檢測(cè)將小鼠安樂死后取腦組織，蔗糖甲醛溶液固定、脫水24 h，將腦組織用OCT包埋、切片，20 μm厚腦切片用Triton-100處理15 min,加50 g/L BSA封閉30 min，加兔抗AQP4抗體(按1∶600稀釋)、雞抗GFAP抗體(按1∶600稀釋)、鼠抗pTau抗體(按1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS洗5遍，加Cy5結(jié)合驢抗鼠抗體(按1∶300稀釋)、Cy5結(jié)合驢抗兔抗體(按1∶300稀釋)、山羊抗雞IgY(按1∶300稀釋)避光室溫孵育2 h，PBS洗5遍，Hoechst33258(按1∶1 000稀釋)染核后甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件分析模型小鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光染色強(qiáng)度評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP與AQP4、pTau蛋白分布情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行分析。采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較4組小鼠腦實(shí)質(zhì)內(nèi)pTau蛋白表達(dá)的差異；采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對(duì)C57小鼠和AQP4+/-小鼠的類淋巴系統(tǒng)示蹤劑EB的殘余熒光面積和AQP4+/-Tau組、C57 Tau組GFAP表達(dá)的差異進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 C57與AQP4+/-小鼠類淋巴引流清除結(jié)果見圖1。與C57小鼠([1.41±0.35)%]相比，AQP4+/-小鼠EB殘余熒光面積[(8.04±0.55)%]減少(t=22.581，P<0.001)。

A:AQP4+/-小鼠;B:C57小鼠;1:大腦內(nèi)殘余EB示蹤劑；2:Hoechst33258染核；A3:A1和A2合圖；B3:B1和B2的合圖

2.2 4組小鼠大腦皮層和紋狀體pTau蛋白的表達(dá)見圖2、表1。外源性Tau蛋白和敲除部分AQP4基因(AQP4+/-)均可增加C57小鼠大腦皮層和紋狀體中pTau蛋白聚集；兩因素具有協(xié)同作用。

A：AQP4+/- Tau組；B:C57 Tau組；C:AQP4+/-PBS組；D:C57 PBS組

2.3 C57 Tau組和AQP4+/-Tau組小鼠大腦皮層GFAP、AQP4和pTau蛋白的表達(dá)見圖3。AQP4+/-Tau組小鼠大腦皮層中較多pTau蛋白聚集，周圍伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，AQP4表達(dá)減少；而C57 Tau組小鼠大腦皮層可見有pTau蛋白的少量聚集，周圍伴有星形膠質(zhì)細(xì)胞少量增多。C57 Tau組和AQP4+/-Tau組小鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)量分別為(19.98±3.65)和(27.46±5.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.729，P=0.002)。

A、C：AQP4+/- Tau組；B、D:C57 Tau組；A1、B1：pTau表達(dá)；C1、D1：AQP4表達(dá)；2:GFAP表達(dá)；3:Hoechst33258染核；4:1～3的合圖

3 討論

AD病理表現(xiàn)為大腦內(nèi)pTau的異常沉積[11-12]。大量研究[13-15]證實(shí)血漿和腦脊液中pTau的檢測(cè)和大腦內(nèi)pTau蛋白沉積量的PET分析有助于AD的早期預(yù)測(cè)和預(yù)后的改善。AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)血管旁星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍AQP4表達(dá)量的減少，提示AD患者pTau的病理出現(xiàn)與大腦血管周圍AQP4表達(dá)定位減少有關(guān)[10]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠模型中AQP4缺失可加重大腦內(nèi)β淀粉樣蛋白的病理沉積。

本研究利用AQP4+/-小鼠構(gòu)建AD模型，在其大腦皮層和紋狀體檢測(cè)到pTau的沉積，發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)量的減少可明顯加重pTau蛋白沉積。此外，我們發(fā)現(xiàn)AQP4+/-Tau組和C57 Tau組小鼠大腦皮層pTau沉積的附近有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多。有研究[17]結(jié)果提示星形膠質(zhì)細(xì)胞與大腦內(nèi)病理性蛋白沉積相關(guān)，在AD患者和小鼠模型中，可發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增多，促進(jìn)病理性蛋白的異常沉積，出現(xiàn)鈣動(dòng)力學(xué)異常，加重有害物質(zhì)的釋放，進(jìn)而損害神經(jīng)元及突觸的重塑。有研究[18]認(rèn)為AD的發(fā)生與大腦類淋巴系統(tǒng)引流功能障礙相關(guān)。AQP4是參與類淋巴系統(tǒng)引流清除過程的水通道蛋白，AQP4的缺失可抑制大腦類淋巴系統(tǒng)清除，引起大腦內(nèi)蛋白和代謝廢物異常沉積。本研究利用EB示蹤大腦類淋巴系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)AQP4+/-小鼠的殘余示蹤劑滲透少于C57小鼠，提示AQP4+/-小鼠出現(xiàn)了類淋巴系統(tǒng)清除障礙。

綜上所述，AQP4低表達(dá)加速大腦皮層pTau蛋白形成和聚集的發(fā)生，可能與類淋巴清除功能障礙有關(guān)。但pTau聚集對(duì)AD小鼠AQP4表達(dá)的影響和抑制類淋巴功能障礙的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。