李 林，楊雙寧，秦國慧，亓妍文，趙坤宇 ，王麗萍

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052

肺癌在全世界發(fā)病率高，是癌癥死亡的主要原因[1-2]。雖然肺癌的治療手段有多種，如手術(shù)、放化療、靶向藥物治療等，但效果仍不理想，5 a的總體生存率較低[3]。近年來隨著腫瘤免疫研究的不斷發(fā)展，免疫治療也逐漸用于臨床并取得較好的療效。以程序性死亡受體-1(programmed cell death 1，PD-1)和程序性死亡受體配體-1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)為代表的免疫檢查點抑制劑的發(fā)展極大地改善了非小細胞肺癌的治療前景[4-5]。PD-1/PD-L1抑制劑阻斷抑制性信號的傳導，恢復部分T細胞殺傷腫瘤細胞的能力[6]。代謝組學近年來發(fā)展迅速，被廣泛應用于疾病的診斷、生物標志物發(fā)現(xiàn)和疾病機制研究，特別在癌癥分子的診斷應用中發(fā)揮重要作用[7]。代謝組學可以用于腫瘤的診斷、治療指導和預后判斷。本研究對一線化療失敗但未使用PD-1抑制劑治療的晚期肺腺癌患者在使用PD-1抑制劑聯(lián)合化療治療前后的血清代謝物進行分析，尋找潛在的生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2020年6月至12月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院接受治療的晚期肺腺癌患者14例，其中男8例，女6例。納入標準：①年齡50～75周歲。②病理以及影像學確診為晚期肺腺癌。③經(jīng)化療后復發(fā)或進展。④美國東部腫瘤協(xié)作組評分為0～1分。排除標準：①既往接受過免疫治療或靶向治療。②肝腎功能嚴重障礙。③嚴重血液系統(tǒng)疾病。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)系統(tǒng)：Ultimate 3000 UHPLC(美國戴安公司)，Q Exactive高分辨率質(zhì)譜(美國賽默飛世爾科技公司)，ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國沃特世公司);CF16RN離心機(日本日立公司)；乙腈和甲醇(UPLC級，美國費希爾公司);甲酸(UPLC級，中國阿拉丁公司)。

1.3 差異代謝物的測定抽取患者第1次使用化療聯(lián)合PD-1抑制劑治療前3 d的外周血(A組)及治療2周期后外周血(B組)各2 mL于EDTA抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存。檢測前，將血清置于冰上溶解并通過渦旋振蕩均勻，取100 μL血清加入300 μL甲醇，再次渦旋5 min混勻后4 ℃、15 000 r/min離心10 min，吸取上清液進行分析。

色譜條件為ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，流動相為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫，流速0.2 mL/min，進樣量5 μL，柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件為電噴霧電離源，采用正、負離子監(jiān)測模式，掃描范圍80.00～1 200.00 m/z，分辨率17 500；正離子模式下噴霧電壓和鞘氣流速分別為3.50 kV和40 μL/min，負離子模式下為2.80 kV和38 μL/min；輔助氣體溫度為300 ℃，離子源溫度為350 ℃，毛細管溫度為320 ℃，輔助氣體流量為10 μL/min。

1.4 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均通過Thermo Xcalibur 3.0(美國賽默飛世爾科技公司)進行處理。將原始數(shù)據(jù)導入Compound Discovery 3.0(美國賽默飛世爾科技公司)進行峰校準、峰匹配和峰對齊，將提取到的數(shù)據(jù)導入 SIMCA 14.0進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，將重要變量性投影>1、P<0.05的指標作為潛在標志物。治療前后的數(shù)據(jù)運用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)進行配對資料的t檢驗以篩選差異代謝通路，P<0.05的代謝通路為差異代謝通路，并將潛在差異化合物的二級譜圖與HMDB數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定。

2 結(jié)果

2.1 血清模式識別分析結(jié)果見圖1。正負離子模式下PCA模型顯示兩組分隔較遠無重疊；OPLS-DA模型顯示兩組樣本點分隔遠。正離子模式下，OPLS-DA 模型相關(guān)參數(shù)R2=0.988和Q2=0.890，負離子模式下R2=0.988和Q2=0.880，均大于0.5，說明模式識別可靠。

A：正離子PCA；B：負離子PCA；C：正離子OPLS-DA；D：負離子OPLS-DA

2.2 差異代謝物的篩選及鑒定正負離子模式下各選出80余種物質(zhì)，通過比對鑒定出有差異的物質(zhì)14種。其中谷氨酰絲氨酸、脯氨酸、犬尿氨酸、脫氫抗壞血酸、N-硬脂酰鞘磷脂、5-羥基吲哚乙酸水平升高，而色氨酸、亮氨酰脯氨酸、檸檬酸、硬脂酸、吲哚丙烯酸、丙酰肉堿、吲哚、3-甲基吲哚水平降低。圖2為14種代謝物水平變化趨勢熱圖。

圖2 差異代謝物熱圖分析結(jié)果

2.3 差異代謝通路分析結(jié)果見表2。

表2 差異代謝通路分析結(jié)果

3 討論

PD-1抑制劑通過阻斷PD-1通路的激活，恢復部分T細胞功能，使這些細胞能夠識別并殺傷腫瘤細胞[8-9]。T細胞的激活、分化和功能緊密依賴于氨基酸的運輸和代謝[10]。腫瘤細胞不僅可以利用氨基酸進行增殖和侵襲，而且還能進行腫瘤免疫逃逸[11-12]。本研究共篩選出14種差異代謝物，1條可能與PD-1抑制劑作用相關(guān)的色氨酸代謝途徑。色氨酸的分解代謝被認為是一種重要的微環(huán)境因子變化。色氨酸的耗竭是導致T細胞無能和凋亡的主要機制之一[13]。吲哚胺-2,3-雙加氧酶是一種能夠催化色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸的酶[14]。色氨酸降解產(chǎn)物犬尿氨酸可以抑制樹突狀細胞抗原提呈功能，從而抑制T細胞的增殖[13]。此外，吲哚胺-2,3-雙加氧酶可能參與了免疫檢查點靶向治療的主要耐藥機制形成[15]。在本研究中，經(jīng)PD-1抑制劑治療后的晚期肺腺癌患者血清犬尿氨酸水平升高，色氨酸水平降低，犬尿氨酸/色氨酸比值升高。

腫瘤的發(fā)生是多種代謝通路共同作用的結(jié)果，目前，免疫治療已經(jīng)在臨床上廣泛使用，但是其作用機制還有待進一步探討。該實驗檢測了經(jīng)一線治療失敗的肺腺癌患者使用PD-1抑制劑聯(lián)合化療治療前后的差異代謝物，分析了可能參與的相關(guān)代謝通路，發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸/色氨酸比值可作為評估該類患者預后的潛在生物標記物。

另外，本研究存在一定的不足。首先由于免疫治療費用較高，入組的患者少，樣本數(shù)量不足；其次使用免疫治療聯(lián)合化療不能排除化療對差異代謝物及代謝通路的影響。今后還需要大量的樣本及更嚴格的入組患者篩選條件進行驗證。