雷宇陽， 李 霽， 趙麗云， 羅 鳴， 陳紅鋒*

( 1. 中國科學(xué)院華南植物園， 中國科學(xué)院植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510650; 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049; 3. 廣東省應(yīng)用植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510650 )

走馬胎()在APGⅢ系統(tǒng)中隸屬于報(bào)春花科紫金牛屬植物，其作為民族藥應(yīng)用已久，最早見之于《陸川本草》及《嶺南采藥錄》，記錄了其治療風(fēng)濕骨痛、跌打損傷及止痛等功效，是黎族、瑤族等少數(shù)民族的常用藥材，有祛風(fēng)補(bǔ)血、活血散瘀、消腫止痛的效用(周澤建，2017)?，F(xiàn)代科學(xué)研究確認(rèn)了走馬胎的藥用價(jià)值，報(bào)道了其藥效成分主要為三萜類、甾醇類、酚類、醌類等次生代謝物(戴衛(wèi)波等，2017)；走馬胎全株組織均有三萜皂苷的存在(魏蓉等，2015)。穆麗華等(2011)、Mu等(2013)在走馬胎中提取了7種三萜皂苷類化合物，其中有1種是首次從紫金牛屬植物體內(nèi)獲得，并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)6類腫瘤細(xì)胞株有一定程度的抑制作用。迄今為止，有關(guān)走馬胎藥用成分的調(diào)控過程及相關(guān)分子基礎(chǔ)的研究尚未見有報(bào)道。

三萜皂苷種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，母核的結(jié)構(gòu)修飾以及調(diào)控包含了許多步驟，涉及多種不同的酶促反應(yīng)，至今仍存在許多不明之處。由于走馬胎遺傳背景的長期缺失，功能基因組方面研究進(jìn)展緩慢，限制了走馬胎三萜皂苷合成分子基礎(chǔ)研究的深入，目前其藥效成分的調(diào)控途徑尚不清晰。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比傳統(tǒng)PCR反應(yīng)具有準(zhǔn)確定量以及不易交叉污染的優(yōu)點(diǎn)，自1992年Higuchi提出以來，廣泛運(yùn)用于研究基因表達(dá)以及克隆新基因的重要技術(shù)等領(lǐng)域(樊慶魯和肖國櫻，2010)。

在植物中，皂苷是一類種類多樣的次生代謝物，其功能是抵御微生物、病菌和其他蟲害(Papadopoulou et al., 1999)。因此，植物的根往往含有更多的此類次生代謝物，相比其他組織，根所處的土壤環(huán)境復(fù)雜，土壤-根系-微生物三者相互作用，需要抵御病蟲害的侵蝕從而刺激相關(guān)防御基因高表達(dá)導(dǎo)致次生代謝的生成(Ji et al., 2015；Rasmann et al., 2011)。同時(shí)，植物的防御反應(yīng)是通過與環(huán)境相互作用刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來誘導(dǎo)的，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通常是由植物激素來完成的。在植物激素中，茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和水楊酸(salicylic acid, SA)是參與防御相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)源植物激素，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生(Wang et al., 2015)。當(dāng)利用SA和MeJA進(jìn)行外源性應(yīng)用時(shí)，它們已被證明可誘導(dǎo)三萜皂苷生物合成相關(guān)基因的上調(diào)(常越等，2016)。

本研究以走馬胎為材料，通過比較根、葉不同組織部位及SA、MeJA激素處理后的三萜皂苷含量的變化，并利用qRT-PCR技術(shù)分析了三萜皂苷合成通路上相關(guān)基因表達(dá)差異。嘗試從分子水平闡釋走馬胎三萜皂苷合成通路關(guān)鍵基因變化，為后續(xù)相應(yīng)的功能基因的驗(yàn)證以及合成生物學(xué)研究提供參考，從而在分子水平上更好推動(dòng)走馬胎這種珍貴的民族藥的保護(hù)和開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為統(tǒng)一播種生長2 a的盆栽走馬胎植株，來源于中國科學(xué)院華南植物園嶺南中藥材保護(hù)品種種質(zhì)資源圃，走馬胎幼苗的種子均產(chǎn)自廣東省南雄市。經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園植物科學(xué)研究中心陳紅鋒研究員鑒定為報(bào)春花科紫金牛屬植物走馬胎()。

1.2 栽培處理

選取生長狀況相似的走馬胎苗分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：水楊酸處理組、茉莉酸甲酯處理組以及對(duì)照組，每組各3株作為3次生物學(xué)重復(fù)。SA與MeJA濃度皆為1 mmol·L，噴施葉面至有液滴滴下，每天8：00、12：00、18：00各處理1次，共處理7 d。對(duì)照組在相同的時(shí)間里進(jìn)行蒸餾水噴施處理。經(jīng)過7 d栽培處理之后，對(duì)3個(gè)組分別進(jìn)行統(tǒng)一采樣，葉片采樣剔除葉脈部分，根部采樣只選取須根部分，把采集到的材料用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

1.3 三萜皂苷含量測(cè)定

總?cè)圃碥蘸繙y(cè)定參考徐睿庸(2007)的方法并加以改進(jìn)。精密移取0.116 mg·mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)液1、2、3、4、5 mL蒸干溶劑后，加0.2 mL現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液。在80 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冰浴冷卻后，各加5 mL乙酸乙酯，在550 nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度(mg·mL)對(duì)吸光度值()進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采集各組走馬胎鮮葉和鮮根，沖去泥沙，挑選并除去雜質(zhì)，盡量避免水浸。放至烘箱，50 ℃恒溫烘干到恒重，取出后移至粉碎機(jī)，打碎后即得粗粉。取粗粉約0.2 g，精密稱定，加入50%乙醇50 mL，室溫下超聲波提取30 min(功率為240 W)，過濾，濾渣與錐形瓶用50%乙醇20 mL分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液于250 mL茄形瓶中，減壓回收溶劑至無醇味(約15 mL)。定量轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入等體積水飽和石油醚(約25 mL)萃取3次，每次振搖2 min，靜置使分層，棄去石油醚層，水層定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度。精密移取走馬胎葉提取液0.5 mL以及根提取液1.0 mL于20 mL具塞試管中，空氣吹干，精確加入0.2 mL現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸及0.8 mL高氯酸，渦旋混勻，80 ℃水浴10 min，緊接著進(jìn)行5 min冷卻，之后加入5 mL乙酸乙酯，混勻，測(cè)定其在550 nm下的吸光度。

三萜皂苷含量(mg·g)=()/。

式中：為根據(jù)吸光度以及標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的三萜皂苷質(zhì)量濃度(mg·mL)；為提取液體積；為樣品粉末質(zhì)量。

1.4 RNA的提取及cDNA文庫的合成

走馬胎的根部和葉部總RNA提取按照EastepSuper總RNA提取試劑盒(LS1040，Promega)建議的流程進(jìn)行操作，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)的效果進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，延長金屬浴裂解樣品時(shí)間以提高提取質(zhì)量。在提取后使用1.0%(/)的瓊脂糖凝膠電泳，NanoPhotometer分光光度計(jì)和Agilent 2100生物分析儀評(píng)估總RNA的質(zhì)量、純度和完整性。反轉(zhuǎn)錄RNA采用Go Scrip Reverse Transcription Mix，Oligo(dT)(A2790，Promega)反應(yīng)體系，按照制造商建議的流程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5 熒光定量PCR分析

根據(jù)本課題組前期對(duì)走馬胎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果(Lei et al., 2022)，以目前研究已鑒定與三萜皂苷合成各個(gè)環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白為對(duì)象，進(jìn)行BLASTP比對(duì)，獲得走馬胎三萜皂苷合成所涉及到的一系列基因，分別編碼的是2個(gè)5-二磷酸月桂酸脫羧酶(5-diphosphomevalonate decarboxylase，PMD，MVA途徑)、1個(gè)4-羥基-3 -甲基丁-2 -烯基二磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-enoyl diphosphate synthase，HDS，MEP途徑)、1個(gè)鯊烯合酶(squalene synthase，SS)、2個(gè)鯊烯單加氧酶(squalene monooxygenase，SM)、5個(gè)細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)家族蛋白以及4個(gè)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronyltransferase，UGT)家族蛋白，并以走馬胎肌動(dòng)蛋白基因-為此次實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。將以上基因通過NCBI ORFfinder工具進(jìn)行開放讀碼框(open reading frame, ORF)預(yù)測(cè)，利用BLASTP確定編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)，根據(jù)各個(gè)基因的CDS序列通過NCBI Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

利用普通PCR來檢驗(yàn)引物的特異性以及cDNA文庫的可用性。PCR的程序：95 ℃變性 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。qRT-PCR的程序：95 ℃預(yù)變性 30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。PCR擴(kuò)增在Eppendorf Mastercycler X50h上進(jìn)行，qRT-PCR反應(yīng)在羅氏 LightCycler 480 qRT-PCR儀上進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)的平均值。

表 1 走馬胎三萜皂苷合成相關(guān)基因引物序列Table1 Primer sequences of enzyme genes related to A. gigantifolia triterpene saponins synthesis

2 結(jié)果與分析

2.1 SA和MeJA處理對(duì)走馬胎根、葉中三萜皂苷含量的影響

將前期分組培養(yǎng)的走馬胎利用分光光度法進(jìn)行總?cè)圃碥盏暮康臏y(cè)定(圖1)。由圖1 可知，3個(gè)處理組(CK、SA、MeJA)根部組織的三萜皂苷含量分別為0.56、0.53、0.52 mg·g，相應(yīng)的葉部組織三萜皂苷含量分別為0.31、0.25、0.25 mg·g。這表明在各個(gè)處理組內(nèi)，走馬胎根部組織的三萜皂苷含量皆遠(yuǎn)高于葉部組織的，證實(shí)了組織之間三萜皂苷的含量存在差異。通過組間比較發(fā)現(xiàn)，無論是葉部組織還是根部組織，2個(gè)處理組相比于CK組三萜皂苷含量皆顯著降低(<0.05)。

柱上不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Different letters above column indicate significant differences (P<0.05).圖 1 各組別走馬胎不同部位三萜皂苷的含量Fig. 1 Content of triterpenoid saponins in different tissues of different A. gigantifolia groups

2.2 三萜皂苷合成相關(guān)基因在走馬胎根和葉中的表達(dá)差異

為了解在不同組織部位之間，三萜皂苷合成相關(guān)基因的具體表達(dá)情況，通過qRT-PCR分析的方法對(duì)CK組的葉與根中15個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)前對(duì)走馬胎根部組織與葉部組織的總RNA質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)估，RNA完整值(RIN)表明RNA降解程度較輕，/值與/值皆在2.0左右。這說明RNA受到較小的蛋白污染以及碳水化合物污染(表2)。根部組織各基因相對(duì)于葉部組織的相對(duì)表達(dá)量如圖2所示，在根部組織中，15個(gè)三萜皂苷合成相關(guān)基因皆有不同程度的上調(diào)。將三萜皂苷含量較低的葉部組織各基因表達(dá)量設(shè)為1，這15個(gè)基因在根中的相對(duì)表達(dá)量分別為1(241.3)、2(2 460.0)、(1 834.4)、1(488.1)、2(78.5)、(4 708.7)、1(4 475.3)、2(135.4)、3(524.4)、4(485.9)、5(69.6)、1(2 242.8)、2(126.6)、3(36.0)、4(8.6)。走馬胎根部組織三萜皂苷合成相關(guān)基因的表達(dá)情況與三萜皂苷在不同組織中的含量差異趨勢(shì)保持一致。

表 2 走馬胎根與葉總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Total RNA quality test results of A. gigantifolia roots and leaves

葉中各基因的表達(dá)量設(shè)為1，數(shù)據(jù)為根相對(duì)葉的表達(dá)量。Expression level of each gene in the leaf is set to 1, and the data in the figure are the expression levels of the root relative to the leaf.圖 2 不同組織間三萜皂苷合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 2 Expression analysis of genes related to triterpenoid saponin synthesis in different tissues

2.3 SA和MeJA處理對(duì)走馬胎三萜皂苷合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

SA和MeJA作為植物激素以及信號(hào)傳導(dǎo)小分子，可以誘導(dǎo)植物進(jìn)行防御反應(yīng)從而產(chǎn)生次生代謝物。本研究在對(duì)走馬胎進(jìn)行SA以及MeJA外源噴施處理之后，將3組植株的葉作為材料進(jìn)行基因表達(dá)量的比較。由表3可知，RNA提取結(jié)果質(zhì)量良好。在上游合成步驟中，2個(gè)處理組與對(duì)照組相比，由異戊二烯單元到合成2,3-環(huán)氧鯊烯過程中所涉及到的基因，除SA組別的1以外，其他基因(如1，2以及2等)皆有不同程度的上調(diào)；而在下游合成步驟中，由2,3-環(huán)氧鯊烯到最終合成三萜皂苷的母核的結(jié)構(gòu)修飾以及糖基化的這2個(gè)過程所涉及到的P450家族以及UGT家族，除SA組別的3以外，其他的都呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)(圖3)。

表 3 兩種激素處理后走馬胎葉總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 3 Total RNA quality test results of A. gigantifolia leaves treated with two hormones

CK組中各基因的表達(dá)量設(shè)為1，數(shù)據(jù)為SA、MeJA組各基因相對(duì)CK組的表達(dá)量。柱上不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Expression level of each gene in the CK group is set to 1, and the data in the figure are the expression levels of each gene in the SA and MeJA groups relative to the CK group. Different letters above column indicate significant differences (P<0.05).圖 3 植物激素處理后三萜皂苷合成相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 3 Expression analysis of triterpenoid saponins synthesis-related genes after plant hormone treatment

3 討論與結(jié)論

本研究利用qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，走馬胎的根部組織相對(duì)于葉部組織，三萜皂苷合成相關(guān)基因皆有不同程度的上調(diào)。這代表植物自主調(diào)控時(shí)在不同組織中三萜皂苷合成相關(guān)基因存在不同的表達(dá)模式，從而導(dǎo)致在走馬胎根部組織內(nèi)三萜皂苷的含量顯著高于葉部組織。Baetz等(2014)研究表明，植物的根可能是最后的三萜皂苷的生物合成和儲(chǔ)存器官。在藥用植物人參中，CYP450家族在根莖中表達(dá)較多，而UGTs在根中表達(dá)較多。這2個(gè)器官可能分別是三萜皂苷生物合成的中間位點(diǎn)和最終位點(diǎn)(Han et al., 2012; Rai et al., 2016)，而在走馬胎的根中也出現(xiàn)了類似的表達(dá)模式。總的來說，植物根系經(jīng)常積累高含量的次生代謝產(chǎn)物，如三萜皂苷。這可能是由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性，根在土壤被迫密切接觸有害微生物和害蟲，因此需要進(jìn)行一系列防御反應(yīng)從而合成次生代謝物(蘇文華等，2005)。

水楊酸(SA)與茉莉酸甲酯(MeJA)皆是一種植物內(nèi)源激素以及信號(hào)傳遞分子，在植物抗環(huán)境脅迫中的信號(hào)傳導(dǎo)作用受到廣泛關(guān)注。前人在對(duì)SA、MeJA進(jìn)行外源應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，這些信號(hào)分子能夠激發(fā)相關(guān)防御基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物次生代謝物的生物合成(常越等，2016；曹伍林等，2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，對(duì)走馬胎進(jìn)行外源SA和MeJA激素噴施處理后的總?cè)圃碥蘸繒?huì)下降。這與積雪草()(Mangas et al., 2006)以及黑種草()(Elyasi et al., 2016)的研究結(jié)果有所不同。進(jìn)一步進(jìn)行本研究表明，2個(gè)處理組相比于對(duì)照組，三萜皂苷合成前期萜類化合物通用步驟相關(guān)基因上調(diào)，后期特異化修飾的相關(guān)基因下調(diào)。這可能代表SA和MeJA等信號(hào)傳遞分子雖然能刺激走馬胎進(jìn)行防御反應(yīng)從而提高萜類化合物含量，但無法使修飾合成三萜皂苷的P450家族以及UGT家族進(jìn)行高表達(dá)從而精確地對(duì)走馬胎三萜皂苷的含量進(jìn)行提升。

對(duì)不同組織間以及不同激素處理間基因表達(dá)模式的差異進(jìn)行分析，合成途徑上游的基因皆上調(diào)，而下游基因表達(dá)模式的不同造成了三萜皂苷含量變化的差異。由此推斷，三萜皂苷含量的提高最有可能是與P450家族以及UGT家族相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)，走馬胎三萜皂苷的合成可能更多地與下游特異化修飾的酶相關(guān)。對(duì)三萜皂苷合成路徑進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩種表達(dá)模式產(chǎn)生差異的節(jié)點(diǎn)是上下游合成途徑的分界點(diǎn)鯊烯，考慮到鯊烯為三萜皂苷和甾醇共同的前體物質(zhì)，可能跟代謝流分流相關(guān)，外源激素的噴施處理可能更多地刺激走馬胎的代謝流流向植物甾醇方向參與維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。雖然有學(xué)者試圖通過過表達(dá)鯊烯合酶基因以提高人參皂苷和柴胡皂苷的含量，但沒有達(dá)到預(yù)期效果，更多地增加了植物甾醇的含量，這與本研究中走馬胎外源激素處理后的表達(dá)模式類似(Lee et al., 2004；Kim et al., 2011)。

綜上所述，不同組織中的特異性積累以及植物信號(hào)分子的誘導(dǎo)都會(huì)導(dǎo)致走馬胎三萜皂苷含量的變化。這些差異與三萜皂苷合成相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。通過植物信號(hào)分子誘導(dǎo)雖然能使萜類化合物合成上游相關(guān)基因進(jìn)行高表達(dá)，但對(duì)某一特定目標(biāo)產(chǎn)物如三萜皂苷可能達(dá)不到預(yù)期效果，在實(shí)際生產(chǎn)中需要精確對(duì)參與修飾三萜皂苷的P450家族以及UGT家族進(jìn)行調(diào)控。此外，在根部三萜皂苷的高積累以及整個(gè)合成步驟相關(guān)基因的高表達(dá)表明，三萜皂苷的產(chǎn)生可能是在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控的。因此，對(duì)于實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)，除了引入多種生物合成酶基因外，轉(zhuǎn)錄因子工程改造可能是一種修飾生物合成途徑的有前途的方法。