陳根振， 王蝴蝶， 裴 棟， 黃新異， 邸多隆,3*

( 1. 甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院， 蘭州 730000； 2. 中國科學院蘭州化學物理研究所， 中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室， 蘭州 730000； 3. 青島市資源化學與新材料研究中心， 山東 青島 266000 )

油橄欖()系木犀科木犀欖屬油料植物，是人類最早認識、馴化和種植的油料作物之一。我國自1964年以來，開始陸續(xù)引種油橄欖品種100多個(張佳等，2013)，現主要在甘肅隴南、云南西北部、四川廣元和達州等地種植(王著，2012)。橄欖油是“地中海膳食模式”中最重要的組成部分之一，是在常溫下通過純物理方法冷榨提取的果肉油，被譽為“飄香的軟黃金”(Guo et al., 2018)。

油橄欖果渣是在橄欖油生產加工過程中產生的副產物，其中含有黃酮類(張華玲等，2016)、萜類(Claro-Cala et al., 2020)和酚類(Css et al., 2019；Speroni et al., 2020)等多種化學成分。據報道，每噸油橄欖鮮果經榨油后會產生350～400 kg果渣(蘇瑤等，2021)。油橄欖果渣作為一種生物廢棄物，一般的處理方式是被當作肥料和燃料處理，或者被當作廢棄物直接丟棄，這些處理方式不但造成了環(huán)境的污染而且忽略了該資源的潛在價值，不符合循環(huán)經濟的理念(張華玲等，2016)。如何提高油橄欖果渣的利用率是油橄欖產業(yè)亟須解決的關鍵性問題。為此，本文以油橄欖果渣為研究對象，通過DPPH·法評價了油橄欖果渣不同提取部位的抗氧化能力，并利用多種柱色譜技術對其主要的抗氧化部位的化學成分進行了系統(tǒng)的研究，分離得到17個化合物，其中，化合物沒食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和蘆丁()為首次從油橄欖果渣中分離得到，為油橄欖果渣抗氧化活性產品的開發(fā)供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

Agilent 1260制備高效液相色譜儀(G1311A 二元泵，G1315D DAD 檢測器，ChemStation 色譜工作站，美國 Agilent 公司)；中壓制備液相色譜系統(tǒng)(NP7010C 二元泵， NU3000C 檢測器，Easy Chrom-1000色譜工作站，江蘇漢邦科技有限公司)； LC-MS 8050三重四極桿質譜儀(日本島津公司)；ULTRA SHIELD 400 plus 核磁共振波譜儀(德國布魯克公司)；高速多功能粉碎機(SS-1022型，武義海鈉電器有限公司)； UV756紫外-可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限責任公司)。

Sephadex LH-20填料(美國GE Healthcare公司)；ODS 色譜柱(SinoChrom ODS-BP，4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱色譜用硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；薄層色譜用硅膠板(GF，青島海洋化工廠)；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)(上海麥克林生化科技有限公司)；維生素C(天津市登峰化學試劑廠)；制備液相所用試劑均為色譜純；提取分離所用試劑均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

實驗用油橄欖果渣經西北師范大學孫坤教授鑒定為木犀科木犀欖屬油橄欖 ()的果實經冷榨提取果肉油后得到的廢棄物，來自隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司。

1.2 提取和分離

稱取干燥的油橄欖果渣3.85 kg，粉碎，75%乙醇(料液比1∶10)回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得橄欖果渣混懸液。加入適量去離子水后，依次用3倍體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，分別得到石油醚部位(164.76 g，標記為部位A)、乙酸乙酯部位(77.61 g，標記為部位B)、正丁醇部位(50.00 g，標記為部位C)和水部位(121.20 g，標記為部位D)，各部位萃取物分別占干燥油橄欖果渣總重量的4.28%、2.02%、1.30%和3.15%。

1.3 抗氧化活性部位篩選

參考李春愛等(2022)的方法略作調整，通過DPPH·的清除能力來確定油橄欖果渣不同提取部位的抗氧化活性。步驟如下。(1)0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液的配制：精密稱取 0.039 5 g DPPH·，加入95%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得1 mmol·LDPPH·乙醇母液，用時取10 mL定容至50 mL，即得0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液。(2)樣品溶液的配制：精密稱取油橄欖果渣不同提取部位浸膏0.010 0 g，加入甲醇定容至10 mL，得到1 mg·mL的樣品溶液，并用甲醇稀釋得到5個質量濃度梯度的樣品溶液，其質量濃度分別為50、100、150、200、250 μg·mL。(3)DPPH·清除能力的測定：將2 mL樣品溶液添加到2 mL含0.2 mmol·LDPPH·乙醇溶液中，混合均勻，室溫放置30 min，在517 nm處測定吸光度。

DPPH·清除率 = [1-(-)/] × 100%。

式中：為樣品的吸光度；為參比的吸光度；為空白的吸光度。

表 1 DPPH·清除率的實驗方法Table 1 Experimental methods of DPPH· scavenging rate

1.4 化學成分分離

取乙酸乙酯部位萃取物(77.61 g)，用少量甲醇溶解，與硅膠拌樣(1∶3)，采用硅膠柱色譜分離。以二氯甲烷-甲醇(比例分別為50∶1、25∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、1∶1)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，使用薄層色譜合并相同的組分，共得到7個部位，編號為Fr.1～Fr.7。其中Fr.2(3.1 g)中析出了大量的白色粉末，重結晶后得到化合物(0.5 g)，Fr.2的剩余部分(2.3 g)采用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)溶劑系統(tǒng)洗脫，分別得到化合物(75.1 mg)、(8.4 mg)、(15.3 mg)、(22.7 mg)。Fr.3(1.8 g)經制備液相色譜(流動相為甲醇和水，0～10 min，甲醇17%；10～20 min，甲醇17%～20%；20～25 min，甲醇20%～30%；25～45 min，甲醇30%～40%；45～60 min，甲醇40%)梯度洗脫，分離得到化合物(8.7 mg)、(10.3 mg)、(9.8 mg)、(23.5 mg)、(7.5 mg)。Fr.4(0.9 g)經制備液相色譜(流動相為甲醇和水，0～10 min，甲醇20%；10～20 min，甲醇20%～30%；20～30 min，甲醇30%)梯度洗脫，并采用Sephadex LH-20柱色譜(流動相為甲醇和水，比例為30∶70)分別純化后得到化合物(9.8 mg)、(10.4 mg)、(7.2 mg)、(9.1 mg)、(10.6 mg)、(6.8 mg)、(8.3 mg)。

2 結果與分析

2.1 活性部位篩選結果

以維生素C(Vc)為陽性對照，測定油橄欖果渣不同提取部位的DPPH·清除率。結果如圖1所示，建立的Vc標準曲線為=1.243 3+0.491 2(=0.995 1)，經計算得Vc的半數抑制濃度(IC)為12.96 μg·mL。如圖2所示，在測定的樣品質量濃度范圍內，隨著樣品質量濃度不斷增加，不同提取部位的DPPH·清除率均不斷增加，且呈現出一定的量效關系。結果表明，在所測定的質量濃度范圍內，油橄欖果渣不同提取部位對DPPH·均有一定的清除能力，油橄欖果渣的石油醚部位(A)、乙酸乙酯部位(B)、正丁醇部位(C)和水部位(D)對DPPH·的IC值分別為3 751.45、119.11、415.00、873.07 μg·mL，即各組DPPH·清除率的大小順序為乙酸乙酯部位(B)>正丁醇部位(C)>水部位(D)>石油醚部位(A)，故乙酸乙酯部位的抗氧化活性較好。

圖 1 維生素C的DPPH·清除率標準曲線Fig. 1 Standard curve of DPPH· scavenging rate of vitamin C

Vc. 維生素C; A. 石油醚部位; B. 乙酸乙酯部位; C. 正丁醇部位; D. 水部位。Vc. Vitamin C; A. Petroleum ether extract; B. Ethyl acetate extract; C. n-Butanol extract; D. Water extract. 圖 2 油橄欖果渣不同提取部位的DPPH·清除率Fig. 2 DPPH· scavenging rates of different extracts of Olea europaea pomace

2.2 化學成分結構鑒定

3 討論與結論

油橄欖果渣是橄欖油加工過程中產生的廢棄物，其化學成分以黃酮類、三萜類和苯丙素類化合物居多，具有抗氧化、抗炎、抗菌和降血糖等藥理作用。本文測定了油橄欖果渣中不同提取部位清除DPPH·的能力，結果表明乙酸乙酯部位具有顯著的抗氧化活性，其DPPH·清除能力的IC值為119.11 μg·mL。在此基礎上，利用多種柱色譜技術從油橄欖果渣的乙酸乙酯部位中分離得到17個化合物，并運用核磁共振波譜等方法鑒定了化合物的結構。17個化合物中，黃酮類化合物有5個、萜類化合物有3個、苯丙素類化合物有3個，其含量分別占乙酸乙酯部位的0.09%、0.79%和0.03%。其中，沒食子酸()、香草酸()、咖啡酸()、丁香酸()和蘆丁()為首次從油橄欖果渣中分離得到的化合物。沒食子酸()、咖啡酸()和丁香酸()均具有明顯的抗氧化、抗炎和抗腫瘤等藥理活性(楊九凌等，2013；鄭雪花等，2017； Kahkeshani et al., 2019；dos Santos et al., 2020)。香草酸()不僅具有抗氧化和抗炎的作用，還能抑制血小板聚集(孔令雷等，2020)，尤其對二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid, AA)和凝血酶(thrombin, THR)誘導引起的血小板聚集具有顯著抑制作用。蘆丁()為一種重要的黃酮類化合物，能夠顯著減弱1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP)誘導的細胞活力喪失，減輕活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產生，并抑制抗氧化酶活性的破壞，此外，蘆丁也降低了用 MPP處理的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中 γH2AX 和COX-2的蛋白質表達水平(Enogieru et al., 2021)。

化合物的抗氧化活性與其結構中羥基的數量有關(原姣姣，2016)，如羥基酪醇()的抗氧化活性高于酪醇()。當化合物有多個酚羥基時，其相對位置決定了抗氧化活性的強弱，即鄰位 >對位>間位。苯環(huán)上4位鍵合碳碳雙鍵或其他供電子基團，可能通過π-π或p-π共軛體系使化合物結構更加穩(wěn)定從而提高抗氧化活性(Xie et al., 2015)，如咖啡酸()的抗氧化活性高于原兒茶酸()和香草醛()。而黃酮類化合物B環(huán)上3′位和4′位的鄰二酚羥基能顯著提高其抗氧化活性(Zuo et al., 2018)，本文中化合物、、、的結構符合這個特征。橄欖苦苷()僅存在于木犀科植物中，由三個結構亞基羥基酪醇、亞麻酸和葡萄糖分子組成，因其具有羥基酪醇的結構，有較強的抗氧化活性。綜上，可初步推測油橄欖果渣的抗氧化活性與其中的黃酮類和裂環(huán)烯醚萜類化合物有關(Liu et al., 2014)。此外，據文獻報道(Joaquín et al., 2018；Jiménez-Herrera et al., 2019；袁靜等，2021；Tian et al., 2021)，乙酸乙酯部位分離得到的17個化合物均表現出不同程度的抗氧化能力，證實了油橄欖果渣具有良好的抗氧化活性。

生物機體內每天不斷產生自由基，過量的自由基造成的氧化損傷對機體形成不可避免的傷害，因此，尋找天然的抗氧化劑就顯得至關重要。油橄欖果渣作為一種生物廢棄物，具有良好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑的原料，如何高效、宏量富集所分離得到的這些化合物，以及如何將其開發(fā)成商品化的天然抗氧化劑，有待于進一步系統(tǒng)和深入的研究。此外，本文為今后油橄欖果渣的高值化利用及天然抗氧化劑的開發(fā)提供了一定的參考依據。