胡 丹， 丁同同， 李 江， 鄧璐璐， 吳樹(shù)燕， 穆淑珍*

( 1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550014； 2. 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550014； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025 )

雷公藤()是衛(wèi)矛科(Celastraceae )雷公藤屬()植物，又名莽草、黃藤木、斷腸草等，主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)、西南地區(qū)以及韓國(guó)、日本等地(利劍余，2017)。雷公藤以根、葉、花及果入藥，其味辛、苦，性寒，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、殺蟲(chóng)解毒等功效(馬哲等，2011)，主要用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎紅斑狼瘡等自身免疫性疾病及各種皮膚病(劉為萍等，2010)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)雷公藤植物的根、葉及果實(shí)等部分進(jìn)行了化學(xué)成分研究。迄今為止，從雷公藤中分離得到單體化合物200多種，主要包括倍半萜、二萜、三萜、木質(zhì)素、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)等(馬偉光等，2006)。其中，二萜、三萜、生物堿類(lèi)化合物是其主要活性成分。在藥理及臨床研究方面，雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗菌、抑制生育等生物活性(Chou & Mei，1936)。隨著生命科學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，有些新發(fā)現(xiàn)使雷公藤物質(zhì)基礎(chǔ)的研究備受關(guān)注。Liu等(2015)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能降低小鼠45%的體重，并可能對(duì)2型糖尿病、脂肪肝等疾病有治療效果；Chang等(2021)研究發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯酮是一種極具轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景的非激素類(lèi)男性避孕候選藥。雷公藤的臨床療效顯著，利劍余(2017)發(fā)現(xiàn)雷公藤具有一定的生理毒性，通常在幾小時(shí)內(nèi)臟器會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的功能障礙以及嚴(yán)重的器質(zhì)性損害，對(duì)肝、腎的毒性最為明顯，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)雷公藤中產(chǎn)生毒性反應(yīng)的成分是其主要活性成分二萜類(lèi)，二萜是雷公藤中目前研究較多的化學(xué)成分。然而，對(duì)雷公藤中其他成分的研究較少，其廣泛的生物活性依然有待繼續(xù)挖掘。

鑒于雷公藤高效的生物活性，為提高雷公藤臨床上的利用度，探究雷公藤中主要物質(zhì)基礎(chǔ)及其他成分的生物活性顯得尤為重要。因此，我們對(duì)雷公藤提取物進(jìn)行了化學(xué)成分的分離與鑒定，并對(duì)得到的化合物進(jìn)行了抗腫瘤的活性篩選。本研究從雷公藤提取物中共分離出12個(gè)單體化合物(圖1)，結(jié)構(gòu)類(lèi)型涉及萜類(lèi)、酚酸類(lèi)和醌類(lèi)。并且，在體外活性篩選方面，首次發(fā)現(xiàn)雷公藤提取物中醌類(lèi)化合物(化合物)具有明顯的抗神經(jīng)母瘤細(xì)胞增殖活性。

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

雷公藤藥材購(gòu)自貴陽(yáng)市花果園藥材中藥市場(chǎng)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)董麗莎教授鑒定為雷公藤()的根部。

SH-SY5Y細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、Hel細(xì)胞株(上海奧陸生物科技有限公司)；甲氨蝶呤水合物(Enetgy Chemical，批號(hào)：DJ210110)；細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342/PI雙染試劑盒(Solarbio Life Sciecnces，批號(hào)：CA1120)；雙抗(青霉素+鏈霉素，HyClone，批號(hào)：J140032)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(40 ～ 70 μm，瑞士Amersham Pharmacia Biotech AB 公司)；柱層析硅膠(200 ～ 300目和300 ～ 400目)，硅膠H (10 ～ 40 μm)和薄層層析硅膠GF254(0.20 ～ 0.25 mm)(青島海洋化工廠)。

1.2 儀器

Sim-HPLC半制備色譜儀(Wasters, Delta 600)；酶標(biāo)儀(Therm scientific, VARIOSKANLUX)；顯微鏡(Leica, Dmi8)；流式細(xì)胞儀(ACEABIO, Novocyte)； ESI-MS電噴霧質(zhì)譜儀(布魯克道爾頓公司)；600 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士Bruker公司)。

2 研究方法

2.1 提取分離

稱(chēng)取雷公藤藥材20 kg，用95%乙醇回流提取3 次，每次3 h。收集提取液濃縮至原體積的 1/3，少量多次加水，濃縮至無(wú)醇味。乙酸乙酯萃取至無(wú)顏色，濃縮旋干萃取液，取適量溶劑溶解，中性氧化鋁拌樣，洗脫劑為乙酸乙酯過(guò)中性氧化鋁層析柱(100～200 目)，濃縮回收溶劑得到雷公藤多苷粗品104 g。

雷公藤多苷粗品用40～80 目硅膠拌樣，使其均勻吸附于硅膠上，10倍量的硅膠柱層析(200～300 目)粗分段，以不同體積比的氯仿∶甲醇(70∶1～1∶1)進(jìn)行梯度洗脫。通過(guò)薄層層析(TLC)跟蹤觀察組分在紫外分析儀下的熒光及顯色情況，合并相似部分，共分為 6 段，標(biāo)記為 Fr.1(400 mg)、Fr.2(2.5 g)、Fr.3(40 g)、 Fr.4(20 g)、Fr.5(40 g)和 Fr.6(4.1 g)。將 Fr.5段先通過(guò)MCI柱，用不同體積比的甲醇∶水混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫比例為50∶1、70∶1、90∶10、100∶0。使用TLC跟蹤觀察組分在紫外分析儀下的熒光及顯色情況，合并相似部分，標(biāo)記為Fr.5.1(200 mg)、Fr.5.2(1.5 g)、Fr.5.3(12.9 g)、Fr.5.4(21.7 g)。將Fr.5.1段經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析及反復(fù)重結(jié)晶得到化合物(8 mg)。將Fr.5.4經(jīng)半制備分離技術(shù)得到化合物(8 mg)、(6 mg)、(12 mg)、(9 mg)和(15 mg)。將Fr.1經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶、正反相硅膠柱層析得到化合物(88 mg)。將Fr.2經(jīng)MCI柱層析、葡聚糖凝膠柱層析及半制備高效液相色譜等分離手段得到化合物(32 mg)、(25 mg)。將Fr.4經(jīng)葡聚糖凝膠粗分段后過(guò)半制備得到化合物(9 mg)、(15 mg)和(12 mg)。

2.2 生物活性測(cè)試

2.2.1 用MTT法篩選化合物活性 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞、K562細(xì)胞、Hel細(xì)胞，重懸得到細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照每孔90 μL的體積將細(xì)胞接種于96孔板中，在5% CO、37 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜待其細(xì)胞貼壁后，加入10 μL含藥培養(yǎng)基，使得藥物終濃度為100、50、20、10、5、2.5 μmol·L，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。于5% CO、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL濃度為5 mg·mL的MTT溶液，放置在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉上清液，每孔加入DMSO 160 μL，震蕩15 min使得甲臜紫色結(jié)晶完全溶解。將96孔板按要求放置于酶標(biāo)儀中，選擇的波長(zhǎng)為490 nm，在此條件下測(cè)定吸光度OD值。根據(jù)測(cè)得的OD值計(jì)算細(xì)胞抑制率。

抑制率(%)=[-]/×100。

2.2.2 Hoechst染色 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞、K562細(xì)胞、Hel細(xì)胞，重懸得到細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，均勻鋪于6孔板中，在5% CO、37 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待其貼壁，細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%時(shí)加入不同濃度的藥物(終濃度為10、20、50 μmol·L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，先加入0.8 mL細(xì)胞染色緩沖液，再加入5 μL Hoechst染色液，最后加入5 μL PI染色液，混勻，4 ℃孵育25 min，棄去染色液，用PBS洗滌1次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。對(duì)K562細(xì)胞和Hel細(xì)胞每個(gè)樣品收集1×10～1×10個(gè)細(xì)胞于1.5 mL離心管內(nèi)，離心，棄去上清液。細(xì)胞沉淀用0.8 mL細(xì)胞染色液重懸，先加入5 μL Hoechst染色液，再加入5 μL PI染色液，混勻，4 ℃孵育25 min，PBS洗滌1次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物無(wú)色油狀液體，ESI-MS：447 [M + Na]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDCl): 5.15/5.21(t,=3.6 Hz, 1H, H-12), 1.10(s, 3H, H-23), 1.06(s, 3H, H-24), 1.08/1.07(s, 3H, H-25), 1.06/1.02(s, 3H, H-26), 1.08/1.15(s, 3H, H-27), 0.81/0.84(s, 3H, H-28), 0.80/0.87(s, 3H, H-29), 0.92/0.87(s, 3H, H-30);C-NMR(150 MHz, CDCl): 218.02(C-3), 145.43/139.88(C-13), 124.36/ 121.67(C-12), 59.30/47.62(C-18), 55.41(C-5), 47.59/47.47(C-4), 47.08/47.03(C-9), 46.94/39.85(C-19), 42.39(C-22), 42.01/41.66(C-14), 40.16/39.94(C-8), 39.75/31.25(C-20), 39.65/39.46(C-1), 37.27/36.84(C-10), 34.88/31.40(C-21), 34.38(C-2), 33.95/32.68(C-17), 33.49/17.64(C-29), 32.62/32.33(C-7), 28.94/28.58(C-28), 28.24(C-15), 27.09/26.75(C-16), 26.64/26.29(C-23), 26.04/23.71(C-27), 23.85/23.81(C-11), 23.35/21.67(C-30), 21.55(C-24), 19.82(C-6), 16.99/16.89(C-26), 15.63/15.39(C-25)。以上數(shù)據(jù)與 Quintǎo等(2014)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為,-amyrenone。

圖 1 化合物1-12結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of compounds 1-12

化合物白色固體粉末，ESI-MS：521 [M + Na]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDCl): 5.28(s, 1H, H-12), 4.51(s, 1H, Hα-3), 2.83(dd,=13.7, 3.9 Hz, 1H, Hβ-18), 2.06(s, 3H, Me-OAc), 1.27(s, 3H, Me), 1.14(s, 3H, Me), 0.95(d,=8.7 Hz, 6H, 2Me), 0.94(s, 3H, Me), 0.92(s, 3H, Me), 0.76(s, 3H, Me);C-NMR(150 MHz, CDCl): 184.49(C-28), 171.08(C=O acetate), 143.61(C-13), 122.54(C-12), 80.94(C-3), 55.29(C-5), 47.55(C-9), 46.56(C-19), 45.83(C-17), 41.53(C-14), 40.88(C-15), 39.27(C-8), 38.06(C-1), 37.69(C-4), 36.99(C-10), 33.79(C-21), 33.07(C-30), 32.51(C-7), 32.44(C-22), 30.67(C-20), 28.04(C-23), 27.66(C-15), 25.92(C-27), 23.59(C-29), 23.52(C-2), 23.39(C-16), 22.85(C-11), 21.32,(CH-acetate), 18.17(C-6), 17.18(C-26), 16.66(C-24), 15.39(C-25)。以上數(shù)據(jù)與 Carvalho和Seita(1993)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3-acetoxyolean-12-en-28-oic acid。

化合物白色固體粉末，ESI-MS：341 [M + Na]，分子式CHO。H- NMR(600 MHz, CDCl): 5.22(dd,=12.0, 2.3 Hz, 1H, H-20), 4.15(d,=12.0 Hz, 1H, H-20), 2.23～0.83(m, 27H, -CH);C-NMR(150 MHz, CDCl): 175.57(C-19), 78.06(C-16), 72.97(C-20), 56.75(C-15), 50.13(C-5), 49.22(C-9), 47.16(C-13), 43.77(C-8), 41.97(C-10), 39.60(C-14), 38.69(C-7), 37.66(C-4), 36.91(C-3), 24.96(C-12), 23.48(C-17), 22.09(C-18), 21.37(C-6), 19.91(C-2), 16.47(C-11)。以上數(shù)據(jù)與 Yu等( 1992)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為antriptolactone。

化合物淡黃色固體粉末，ESI-MS：219 [M + Na]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 7.53(t,=8.5 Hz, 1H, H-6′), 7.50(s, 1H, H-2′), 6.82(d,=8.2 Hz, 1H, H-5′), 3.91(m, 2H, H-3), 3.86(s, 3H, OCH), 3.10(m, 2H, H-2);C-NMR(150 MHz, CDOD): 198.30(C-1), 152.07(C-4′), 147.71(C-3′), 129.18(C-1′), 123.36(C-6′), 114.43(C-5′), 110.47(C-2′), 57.54(C-3), 54.98(OCH), 40.26(C-2)。以上數(shù)據(jù)與 Fu等(2008)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為-hydroxypropioquaiacone。

化合物黃色固體粉末，ESI-MS：177 [M-H]，分子式CHC。H-NMR(600 MHz, CDCl): 9.54(t,=6.5 Hz, 1H, H-3), 7.37～7.31(m, 1H, H-2′), 7.04(dd,=8.2, 1.9 Hz, 1H, H-6′), 7.00(d,=1.9 Hz, 1H, H-5′), 6.88(dd,=11.6, 7.4 Hz, 1H, H-1), 6.52(dd,=15.8, 7.8 Hz, 1H, H-2), 3.87(d,=4.2 Hz, 3H, OCH);C-NMR(150 MHz, CDCl): 194.10(C-3), 153.75(C-3′), 149.35(C-4′), 147.27(C-1′), 126.43(C-2), 126.08(C-1), 124.15(C-6′), 115.18(C-5′), 109.77(C-2′), 55.97(OCH)。以上數(shù)據(jù)與 Wang等( 2012)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-propenal。

化合物白色固體粉末，ESI-MS：167 [M-H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 6.72(d,=1.7 Hz, 1H, H-2), 6.63(d,=8.0 Hz, 1H, H-6), 6.57(dd,=8.0, 1.8 Hz, 1H, H-5), 3.75(s, 3H, OCH), 3.63(t,=7.2 Hz, 2H, H-2′), 2.65(t,=7.1 Hz, 2H, H-1′);C-NMR(150 MHz, CDOD): 147.44(C-3), 144.48(C-4), 130.44(C-1), 121.01(C-6), 114.72(C-5), 112.29(C-2), 63.15(C-2′), 54.96(OCH), 38.44(C-1′)。以上數(shù)據(jù)與Liu和Luo(2012)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3-methoxy-4-hydroxy phenylethanol。

化合物白色無(wú)定性粉末，ESI-MS：151 [M-H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 9.68(s, 1H, CHO), 7.37(d,=6.5 Hz, 2H, H-2, 6), 6.89(d,=8.6 Hz, 1H, H-5), 3.86(s, 3H, OCH);C-NMR(150 MHz, CDOD): 191.43(C-7), 153.38(C-4), 148.25(C-3), 128.94(C-1), 126.66(C-6), 115.17(C-5), 109.73(C-2), 54.99(C-8)。以上數(shù)據(jù)與Kwon等(2001)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為vanillin。

化合物白色無(wú)定性粉末，ESI-MS：185 [M + H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 6.01(s, 2H, H-2, 6), 3.68(s, 6H, 3, 5-OCH), 3.58(s, 3H, 4-OCH);C-NMR(150 MHz, CDOD): 154.04(C-3, 5), 153.56(C-1), 130.74(C-4), 92.54(C-2, 6), 59.92(4-OCH), 54.98(3, 5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與柳慶龍等(2017)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為3, 4, 5-三甲氧基苯酚。

化合物白色固體粉末，ESI-MS：137 [M-H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 7.76(2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.74(2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5);C-NMR(150 MHz, CDOD): 168.86(COOH), 161.88(C-4), 131.66(C-2, 6), 121.34(C-1), 114.71(C-3, 5)。以上數(shù)據(jù)與王洪平等(2013)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物淡黃色固體粉末，ESI-MS：123 [M + H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDOD): 9.66(s, 1H, CHO), 7.67(d,= 8.7 Hz, 2H, H-2, 6), 6.82(d,=8.6 Hz, 2H, H-3, 5);C-NMR(150 MHz, CDOD): 191.52(CHO), 163.79(C-4), 132.11(C-2, 6), 128.87(C-1), 115.53(C-3, 5)。以上數(shù)據(jù)與錢(qián)群剛等(2019)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物淡黃色固體粉末，ESI-MS：153 [M-H]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz,CDOD): 6.97(s, 1H, H-5), 6.78(s, 2H, H-3, 6), 4.53(s, 2H, H-1′), 3.85(s, 3H, OCH);C-NMR(150 MHz, CDOD): 147.56(C-3), 145.54(C-5), 132.84(C-1), 119.71(C-4), 114.59(C-2), 110.73(C-6), 63.93(C-7), 54.95(OCH)。以上數(shù)據(jù)與Challice等(1980)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為vanillyl alcohol。

化合物黃色固體粉末，ESI-MS：191 [M+Na]，分子式CHO。H-NMR(600 MHz, CDCl): 5.88(s, 2H, H-3, 5), 3.84(s, 6H, OCH×2);C-NMR(150 MHz, CDCl): 176.70(C-1), 186.48(C-4), 157.33(C-2, 6), 107.43(C-3, 5), 56.50(OCH×2)。以上數(shù)據(jù)與Kwon等(2001)報(bào)道一致，故鑒定該化合物為2, 6-dimethxy-1, 4-benzoquinone。

4 生物活性測(cè)試結(jié)果

4.1 用MTT法篩選化合物活性

本研究首先對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。采用SH-SY5Y細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、Hel細(xì)胞株檢測(cè)化合物的抗腫瘤作用，表1結(jié)果表明，給藥濃度為50 μmol·L時(shí)化合物對(duì)K562細(xì)胞株和Hel細(xì)胞株具有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制作用。由于化合物給藥濃度50 μmol·L時(shí)，SH-SY5Y細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、Hel細(xì)胞株均具有很強(qiáng)的抑制作用，因此對(duì)其IC值進(jìn)行了測(cè)定(陽(yáng)性藥為甲氨蝶呤水合物，給藥濃度為1 mg·L)，結(jié)果顯示化合物對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞株、K562細(xì)胞株、Hel細(xì)胞株均有較強(qiáng)的抑制率，IC值分別為(35.6±2.8)、(28.8±0.5)、(14.3±0.9)μmol·L。

表 1 化合物1-12在不同給藥濃度下對(duì)各種腫瘤細(xì)胞系的抑制率 (單位：%)Table 1 Inhibition rates of compounds 1-12 against various cancer cell lines at different dosing concentrations (Unit: %)

4.2 Hoechst染色

為進(jìn)一步檢測(cè)化合物的促凋亡作用，我們分別對(duì)不同濃度化合物作用的細(xì)胞用細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33344/PI雙染試劑盒進(jìn)行了染色處理，SH-SY5Y細(xì)胞株為貼壁細(xì)胞，染色后用熒光顯微鏡拍攝染色劑對(duì)細(xì)胞核的染色情況。圖2結(jié)果顯示，與空白組相比，給藥組細(xì)胞皺縮變圓、核膜破裂、核質(zhì)流出，且具有明顯的劑量依賴(lài)性。由于K562細(xì)胞株和Hel細(xì)胞株為半貼壁細(xì)胞，其染色后難以用熒光顯微鏡拍出清晰的圖片，因此采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡情況。從圖3和圖4的結(jié)果可以看出，與空白組相比，隨著化合物濃度的增加，兩種細(xì)胞凋亡比例也隨之增加，表明化合物可以促進(jìn)2種細(xì)胞的凋亡，且該作用和濃度呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

1為空白組; 2，3，4的給藥濃度分別為10、20、50 μmol·L-1。1 in the figure is the blank group; Administration concentrations of 2, 3, and 4 are 10, 20 and 50 μmol·L-1, respectively.圖 2 SH-SY5Y細(xì)胞在化合物12作用下Hoechst熒光染色圖Fig. 2 Hoechst fluorescence staining image of SH-SY5Y cells under the action of Compound 12

A. Hel細(xì)胞在化合物12作用下的流式檢測(cè)圖; B. K562細(xì)胞在化合物12作用下的流式檢測(cè)圖。0、5、10、20分別代表藥濃度為0、5、10、20 μmol·L-1，下同，其中E1為進(jìn)樣細(xì)胞中的活細(xì)胞，PE和APC分別代表藻紅蛋白與別藻藍(lán)蛋白，H代表電脈沖信號(hào)高度。A. The flow cytometry diagram of Hel cells under the action of compound 12; B. The flow cytometry diagram of K562 cells under the action of Compound 12. 0, 5, 10, and 20 respectively represent the drug concentration of 0, 5, 10, 20 μmol·L-1, the same below, where E1 is the live cell in the injection cell, PE and APC represent phycoerythrin and allophycocyanin, H represents the height of the electrical pulse signal.圖 3 Hel細(xì)胞和K562細(xì)胞在化合物12作用下流式檢測(cè)圖Fig. 3 Flow cytometric image of Hel cell and K562 cell under the action of Compound 12

圖 4 不同濃度藥物對(duì)兩種細(xì)胞的凋亡柱狀圖Fig. 4 Histogram of apoptosis of two kinds of cells with different concentrations of drugs

5 討論與結(jié)論

本研究從雷公藤醇提物中共分離鑒定了醌類(lèi)化合物1個(gè)，萜類(lèi)化合物3個(gè)以及酚酸類(lèi)化合物8個(gè)，并對(duì)這些化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選發(fā)現(xiàn)，化合物、、、對(duì)不同腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)出一定的抑制活性，其中醌類(lèi)化合物的抗腫瘤活性最為顯著，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞株、Hel細(xì)胞株、K562細(xì)胞株的IC值分別為35.6、14.3、28.8 μmol·L(文獻(xiàn)值IC=25.5 μmol·L)(劉睿等, 2005)。這是化合物首次報(bào)道對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞株和Hel細(xì)胞株的增殖影響，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

雷公藤的生物活性研究主要集中于二萜、三萜和生物堿，大量研究表明，這些活性物質(zhì)均有一定的毒性，其中二萜類(lèi)成分毒性最大，如雷公藤甲素對(duì)人乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌均有明顯的抑制作用，特別是對(duì)卵巢癌，平均半數(shù)生長(zhǎng)(G150)顯著低于紫杉醇(Guan et al., 1989)，但其對(duì)肝細(xì)胞卻具有明顯的損傷作用且具有一定的劑量依賴(lài)性(Zhang et al., 2016)；雷公藤紅素的抑瘤率為65%～93%，超過(guò)了紫杉醇(翟邊，2016)，而雷公藤紅素對(duì)心血管系統(tǒng)卻有著潛在的危害。這一原因大大限制了雷公藤在臨床上的推廣與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)的醌類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，而關(guān)于該植物中醌類(lèi)化合物的生物活性尚未見(jiàn)報(bào)道。這一研究表明了雷公藤中的醌類(lèi)化合物在抗神經(jīng)母瘤細(xì)胞方面具有很大的潛力，這為后續(xù)雷公藤中其他活性成分的開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。