賈 媛 高 蘭 公 雯

南京市江寧中醫(yī)院藥學部，江蘇南京 211100

頸椎病是臨床常見的退行性疾病，主要由頸椎間盤變性等引起。臨床主要表現為頸肩部出現陣發(fā)性痙攣或麻木，嚴重者可致四肢癱瘓[1]。隨著人口老齡化加劇，工作、生活習慣的改變，其發(fā)病率逐年升高，且年輕化趨勢顯著。

項痹暈寧湯作為南京市江寧中醫(yī)院經典驗方，臨床上已使用多年。組方為葛根、天麻、當歸、炒白芍、玄胡、柴胡、川芎、姜半夏八味，諸藥合用，對于頸椎病臨床療效顯著。但因組方復雜，其作用機制尚不明確。

網絡藥理學通過藥理學、生物信息學等多學科的融合，能夠初步揭示中藥-成分-疾病的作用機制[2]。本研究運用網絡藥理學初步探究項痹暈寧湯治療頸椎病的機制，為后續(xù)新藥開發(fā)和臨床應用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及靶點預測

選擇TCMSP、BATMAN-TCM等數據庫，以組方中八味中藥為關鍵詞檢索化學成分，未被收錄的中藥通過文獻檢索。以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為限制條件篩選活性成分。再通過TCMSP數據庫對活性成分進行靶點預測，并用UniProt數據庫進行規(guī)范。

1.2 構建“活性成分-靶點”網絡

將獲得的潛在靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性成分-潛在靶點”網絡，用“節(jié)點”表示活性成分或潛在靶點，用“邊”表示兩者潛在關系；再通過Network Analyze工具分析計算，以推測活性成分和靶點之間的內在聯系[3]。

1.3 篩選頸椎病相關靶點

以“Cervical spondylosis”“Neck pain”作為關鍵詞，檢索GeneCards、Drugbank等疾病數據庫，整合與頸椎病相關的靶基因，利用Uniprot數據庫進行規(guī)范。

1.4 構建蛋白相作網絡（PPI）及篩選核心靶點

分別將成分潛在靶點及疾病靶點導入Cytoscape軟件，生成PPI網絡后，合并提取交集網絡。再利用CytoNCA分析各個節(jié)點的屬性值，并計算交集PPI網絡拓撲學特征屬性值，并對其進行策略篩選，最終得到關鍵核心靶點。

1.5 通路富集分析

將上述核心靶點導入Metascape數據庫，對其進行GO及KEGG富集分析，并將結果進行可視化。

2 結果

2.1 活性成分及靶點獲取

項痹暈寧湯中滿足條件的活性成分有葛根4種、天麻4種、當歸2種、炒白芍8種、玄胡49種、柴胡13種、川芎6種、姜半夏12種，結果見表1。經靶點預測共獲得244個藥物靶點。

2.2 “活性成分-靶點”網絡構建及分析

將項痹暈寧湯成分與靶點關系網絡通過Cytoscape軟件繪制與分析，獲得336個節(jié)點（其中84個活性成分和244個潛在藥物靶點）與1998條關系，結果見圖1。根據表1、圖1可知，與潛在靶點連線較為緊密的成分有槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等，推測這些化合物可能為項痹暈寧湯主要活性成分。

表1 項痹暈寧湯活性成分

圖1 活性成分-靶點網絡圖

2.3 頸椎病相關靶點檢索

檢索GeneCards、Drugbank數據庫，匯總整理，累計獲得1032個疾病靶點。其與藥物靶點交集有105個。

2.4 項痹暈寧湯-頸椎病的PPI網絡分析

運用Cytoscape軟件構建交集PPI網絡。結果顯示，與藥物相關靶點5527個，相互關系136 070種；與頸椎病相關靶點有11 207個，相互關系226 832種，再取交集PPI網絡。依據交集PPI的網絡拓撲學特征屬性值，篩選獲得關鍵核心靶點204個，見圖2。計算Degree值，其中排名靠前的神經營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體 1（NTRK1）、腫瘤蛋白 P53（TP53）、表皮生長因子受體（EGFR）、淀粉樣前體蛋白（APP）等可能是項痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點。

圖2 核心靶點PPI網絡

2.5 項痹暈寧湯治療頸椎病通路富集分析

將關鍵核心靶點導入Metascape，分別對GO及KEGG進行富集分析，選取Log10（P）值排名前20的結果繪制氣泡圖，氣泡面積即基因計數，橫坐標為通路基因占全部基因的比率，具體見圖3～6。通過P值篩選，結合文獻，其關鍵的信號通路可能包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。

圖3 GO BP分析

3 討論

頸椎病是因勞損或風寒濕邪入體，痹阻手太陽經脈，不通則痛；臨床也認為該病是機體氣血不足，筋脈失養(yǎng)后，氣血虛和太陽經脈瘀滯所致[4]。項痹暈寧湯是在中醫(yī)理論基礎上，結合臨床用藥經驗組方而成，主要用于治療頸椎病所致的頭頸痛、頭暈目眩等臨床癥狀。

圖4 GO CC分析

圖5 GO MF分析

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

本研究共篩選出84種活性成分，244個藥物靶點。項痹暈寧湯治療頸椎病的主要成分可能為槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山奈酚、卡維丁等。槲皮素通過上調神經元的內在生長能力和延緩遠端萎縮，增強軸突再生和運動神經傳導；此外還增加了環(huán)磷酸腺苷的表達和下游通路的激活，促進小鼠坐骨神經擠壓傷后的行為恢復[5-6]。豆甾醇能夠通過對抗IL-1β誘導的細胞凋亡NF-κB通路，減少骨關節(jié)炎引起的軟骨退化[7]；也可抑制基質金屬蛋白酶的表達，減少軟骨的降解[8]。β-谷甾醇通過減少合成NO，減少炎性因子的分泌[9]。山柰酚能抑制血小板活化，預防和治療血栓性疾病[10]。卡維丁可能通過受體阻斷或刺激疼痛神經末梢釋放來產生鎮(zhèn)痛作用[11]。

PPI網絡結果顯示項痹暈寧湯靶點與頸椎病靶點間存在諸多交互關系，篩選后共得出204個核心靶點。根據Degree值排名，NTRK1、YP53、EGFR、APP等可能是項痹暈寧湯治療頸椎病的主要靶點。GO分析發(fā)現，項痹暈寧湯主要涉及DNA修復、細胞應激反應調節(jié)、對生長因子反應等生物學過程；涉及蛋白質域特異性結合、轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合等細胞組分。KEGG生物途徑中看出，PI3K/Akt信號通路激活可抑制頸肌細胞凋亡，修復勞損頸肌，恢復頸椎的靜力平衡[12]。TNF信號通路中TNF-α是引起退變椎間盤炎癥反應的始動因子，可引起IKK活化，加重炎癥損傷。此外miR-146受到TNF-α等刺激時負反饋調節(jié)炎癥性細胞因子的產生[13-14]。MAPK可能通過炎癥引起的神經病理性疼痛潛在的藥物干預靶點參與細胞增殖分化[15]。