楊 娟，曹玉爽，徐 耀，杜鑫苑，張 彤，郭莉琛，袁 慶，柴麗娟，胡利民

(天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院、天津市中藥藥理學重點實驗室、方劑學教育部重點實驗室，天津 301600)

缺血性腦卒中損傷的生理病理過程復雜多樣，主要涉及細胞凋亡、氧化應激、細胞內(nèi)鈣離子超載等，這些機制發(fā)生在不同時期，但又相互聯(lián)系，最終引發(fā)缺血中心區(qū)域組織的不可逆損傷[1]。星形膠質(zhì)細胞約占腦膠質(zhì)細胞的一半，是膠質(zhì)細胞中最豐富的亞型，對成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能至關重要，執(zhí)行多種功能，如維持正常的腦功能，形成血腦屏障，控制和支持神經(jīng)元，循環(huán)神經(jīng)遞質(zhì)，以及與其他細胞通信[2]，因此研究星形膠質(zhì)細胞具有重要的意義。

丹參三七是臨床上常用的藥對，目前在預防和治療心腦血管疾病中使用較為頻繁，Sal B是丹參水溶性酚酸類成分[3]，研究表明其抗腦缺血/再灌注損傷作用機制主要為血流動力學的改善、氧化損傷減輕；改善能量代謝障礙、減輕腦部水腫；維持血腦屏障完整性等[4]。Rg1和R1均是三七總皂苷類成分，具有廣泛的藥理活性，可改善急性缺血性腦卒中后血腦屏障通透性，減少腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損等[5-6]。課題組前期研究結(jié)果顯示，Sal B、Rg1、R1可透過血腦屏障且在腦脊液中含量較高，故在本研究中建立氧糖剝奪/復氧復糖(OGD/R)模型在體外模擬缺氧缺血損傷，探討Sal B、Rg1、R1能否通過降低氧化應激反應和鈣離子超載，發(fā)揮保護星形膠質(zhì)細胞的作用，從而進一步提高星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放。

1 材料與方法

1.1 實驗動物24 h內(nèi)新生Wistar乳鼠，雌雄均可，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，使用許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥品與試劑丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)，生產(chǎn)批號：18062901；人參皂苷Rg1(ginsenoside，Rg1)，生產(chǎn)批號：18071601；三七總皂苷R1(notoginsenoside，R1)，生產(chǎn)批號：18020908；以上藥物均由成都菲普德生物科技有限公司提供，產(chǎn)品純度≥98%。L-谷氨酰胺、胎牛血清(美國Gibco公司)。BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。Anti-GFAP(美國Abcam公司)、Anti-PI3K/p-PI3K、Anti-AKT/p-AKT、Anti-STAT3/p-STAT3(美國CST公司)。CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)。Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit(武漢賽維爾生物科技有限公司)。SYBR GREEN PCR master Mix(美國Applied Biosystem公司)。Tetramethylrhodamine(TMRM)、CM-H2DCFDA(美國Invitrogen公司)、Fluo-3,AM(凱基生物)。

1.3 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(美國Zeiss公司)；缺氧小室(加拿大STEMCELL Technologies)；倒置熒光顯微鏡(美國BioTek公司)；實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)；流式細胞儀(美國，BD，F(xiàn)ACS Calibur)；Western blot凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.4 方法

1.4.1星形膠質(zhì)細胞分離、培養(yǎng)及鑒定 星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)參考湯婷婷等[7]方法，取5只Wistar大鼠乳鼠，75%乙醇浸泡消毒處死，無菌條件下眼科剪打開顱骨取出全腦，置于預冷的D-Hanks中去除腦膜。而后用含5%青霉素-鏈霉素的D-Hanks)浸泡2次，2 min/次。眼科剪剪碎組織成1 mm3的乳糜狀，加入濃度為0.25%的胰酶5 mL，37 ℃、90 r·min-1條件下恒溫震蕩消化10 min。加入5 mL培養(yǎng)基(15% FBS+1%青霉素-鏈霉素+1% L-谷氨酰胺+ 83% DMEM/F12)終止消化，混勻。1 000 r·min-1離心，10 min。加10 mL培養(yǎng)基重懸，過200目篩網(wǎng)。再次離心、重懸，接種細胞于75 cm2培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱5% CO2、37 ℃培養(yǎng)1 h后，將上層培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)瓶中，每3 d換液1次，待細胞融合后將細胞培養(yǎng)瓶放在搖床上260 r·min-1轉(zhuǎn)速下震搖20 h，棄去原培養(yǎng)基，D-Hanks洗滌細胞兩次，加入濃度為0.25%的胰酶消化，傳代備用。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并用免疫熒光鑒定法對其進行純度鑒定(膠質(zhì)纖維酸性蛋白，GFAP)。

1.4.2OGD/R模型的建立及分組 將細胞種于96孔板中，待細胞生長至融合時，根據(jù)魏愛宣等[8]的實驗方法進行細胞OGD/R造模。

對照組(con)將原培養(yǎng)基置換為新配制的DMEM/F12培養(yǎng)基，放于CO2培養(yǎng)箱5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，4 h后換為血清濃度減半的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；模型組將原培養(yǎng)基置換為EBSS平衡鹽溶液，置于缺氧小室中，通入95% N2、5% CO2氣體，5 min后放恒溫搖床(37 ℃)培養(yǎng)4 h，而后從缺氧小室中取出細胞，將EBSS平衡鹽溶液置換為血清濃度減半的培養(yǎng)基，放在CO2恒溫培養(yǎng)箱24 h；給藥組在模型組的基礎上，復氧時換為含有Sal B、Rg1或R1的血清濃度減半的培養(yǎng)基，根據(jù)課題組前期研究及北京中醫(yī)藥大學相關的研究[9]，在此我們選擇的給藥濃度為10 μmol·L-1。

1.4.3CCK-8測定細胞活力 將星形膠質(zhì)細胞按1×105個/ cm2密度接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長至融合后，分別將原培養(yǎng)基置換為含有10 μmol·L-1Sal B、Rg1、R1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后棄去細胞培養(yǎng)基，100 μL DMEM(含10% CCK-8)孵育30 min，酶標儀450 nm波長處檢測吸光度。

Sal B、Rg1及R1對OGD/R星形膠質(zhì)細胞活力的影響同前，按照“1.4.2”處理方法對細胞進行OGD，復氧時將細胞培養(yǎng)基置換為含有10 μmol·L-1Sal B、Rg1或R1的血清濃度減半的培養(yǎng)基。24 h后棄去原培養(yǎng)基，CCK-8檢測細胞活力。

1.4.4流式細胞術檢測星形膠質(zhì)細胞ROS的釋放量、線粒體膜電位和鈣離子濃度 將星形膠質(zhì)細胞按1×105個/cm2密度接種于6孔板中，按照“1.4.2”所述進行分組處理，PBS洗滌細胞，分別加入100 nmol·L-1TMRM工作液，5 μmol·L-1CM-H2DCFDA工作液和0.25 μmol·L-1Fluo-3,AM工作液37 ℃避光孵育30 min，胰酶消化，將細胞收集于離心管中，流式細胞儀測定細胞ROS的釋放量，線粒體膜電位和鈣離子濃度。

1.4.5RT-PCR法測定星形膠質(zhì)細胞IGF1a、BDNF、NGF mRNA的表達 將星形膠質(zhì)細胞按1×105個/cm2密度接種于6孔板中，按照“1.4.2”所述進行分組處理，用預冷的PBS洗滌細胞，TRIzol?reagent試劑盒提取總RNA，超微量核酸分析儀測定RNA樣品濃度，采用Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說明書步驟依次加入反應物，在Real Time PCR儀上檢測各樣本基因表達，將mRNA水平標準化為GAPDH水平，用2-△△Ct法計算相對表達水平。

1.4.6Western blot法測定星形膠質(zhì)細胞p-PI3K、p-AKT、p-STAT3蛋白的表達 將星形膠質(zhì)細胞按1×105個/cm2密度接種于6孔板中，按照“1.4.2”所述進行分組處理，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，加入100 μL細胞裂解液(含1% PMSF)提取總蛋白并進行蛋白定量；將10 μg樣品加到聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行分離，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用脫脂奶粉5%封閉，分別加入p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p-PI3K(1 ∶1 000)、PI3K(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、AKT(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌條帶4次，5 min/次，而后加入二抗(1：10 000)，室溫搖床孵育1 h，洗滌后用ECL化學顯色試劑在顯影儀中曝光，通過ImageJ處理系統(tǒng)分析目的蛋白條帶灰度值并計算相應蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察及鑒定如Fig 1，光鏡下觀察培養(yǎng)7 d的星型膠質(zhì)細胞，形狀主要為不規(guī)則多角形，可見粗短枝狀胞突，胞體大而扁平，符合神經(jīng)膠質(zhì)細胞生長特性；膠質(zhì)細胞特異性蛋白GFAP免疫熒光染色呈陽性，表明純度較高的原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)成功，可以用于后續(xù)實驗。

Fig 1 Left:Astrocyte morphology under light microscope,bar=100 μm.Right:Immunofluorescence identification of astrocytes (GFAP),bar=200 μm

2.2 Sal B、Rg1、R1對星形膠質(zhì)細胞活力的影響如Tab 1所示，與con組比較，Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)對正常星形膠質(zhì)細胞活力差異均沒有顯著性(P>0.05)，表明實驗所選藥物濃度對細胞沒有毒性。OGD/R組星形膠質(zhì)細胞活力與con組比較明顯降低(P<0.05)；與OGD/R組比較，Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)均能明顯提高OGD/R受損膠質(zhì)細胞的活力(P<0.05),表明選擇的10 μmol·L-1可以用于后續(xù)實驗。

Tab 1 Effects of Sal B,Rg1,R1 (10 μmol·L-1) on viability of

2.3 Sal B、Rg1、R1對OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞ROS釋放量的影響腦缺血發(fā)生后，損傷的星形膠質(zhì)細胞釋放大量ROS，H2O2是其主要成分，具有不帶電荷、穩(wěn)定以及可自由彌散等特點，可以任意穿過細胞膜，進一步導致?lián)p傷，本研究通過檢測星形膠質(zhì)細胞中ROS的產(chǎn)生來評估氧化損傷，如Fig 2所示，OGD/R組細胞ROS釋放量較con組明顯增加(P<0.05)；與OGD/R組相比，Sal B、Rg1(10 μmol·L-1)均可明顯降低OGD/R損星形膠質(zhì)細胞ROS的釋放量(P<0.05)，表明Sal B、Rg1(10 μmol·L-1)可以減輕星形膠質(zhì)細胞的氧化損傷。

Fig 2 Effects of Sal B,Rg1,R1 (10 μmol·L-1) on ROS of astrocytes injured by OGD/R detected *P<0.05 vs con;#P<0.05 vs OGD/R.

2.4 Sal B、Rg1、R1對OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞線粒體膜電位的影響線粒體膜電位可以影響線粒體中鈣離子的攝取，是細胞主要鈣離子調(diào)節(jié)器，細胞內(nèi)線粒體膜電位升高會導致鈣離子濃度增加，鈣超載線粒體和后續(xù)功能障礙誘導細胞死亡。本研究中用流式細胞術檢測了細胞線粒體膜電位，結(jié)果如Fig 3所示，與con組相比，OGD/R組星形膠質(zhì)細胞線粒體膜電位降低(P<0.05)；與OGD/R組相比，Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)均可升高OGD/R損傷后星形膠質(zhì)細胞的線粒體膜電位(P<0.05)，表明Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)可以抑制損傷星形膠質(zhì)細胞線粒體膜電位的降低，對細胞發(fā)揮保護作用。

Fig 3 Effects of Sal B,Rg1 and R1 (10 μmol·L-1) on mitochondrial membrane potential of OGD/R injured astrocytes detected by flow cytometry *P<0.05 vs con;#P<0.05 vs OGD/R.

2.5 Sal B、Rg1、R1對OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞鈣離子濃度的影響研究進一步對細胞內(nèi)鈣離子濃度進行了檢測，如Fig 4，發(fā)現(xiàn)與con組相比，OGD/R組星形膠質(zhì)細胞鈣離子濃度明顯升高(P<0.05)；與OGD/R組相比，Sal B(10 μmol·L-1)可明顯降低OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞鈣離子濃度(P<0.05)，抑制鈣離子超載。

2.6 Sal B、Rg1、R1對OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)生長因子分泌的影響星形膠質(zhì)細胞分泌的BDNF、NGF、IGF1α對于成年大腦中特定神經(jīng)元群體的存活，維持和再生很重要，本研究采用RT-PCR方法檢測Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)對損傷星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、IGF1α分泌的影響(Fig 5)，與con組相比，OGD/R組細胞BDNF、NGF mRNA表達明顯降低(P<0.05)，對IGF1α mRNA無明顯降低(P>0.05)；與OGD/R組相比，Sal B、Rg1、R1(10 μmol·L-1)均可明顯升高OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞BDNF mRNA的表達(P<0.05)；Rg1可提高NGF mRNA表達(P<0.05)；Sal B可明顯升高OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞IGF1α mRNA表達(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)不同的活性成分對BDNF、NGF、IGF1α mRNA有不同程度的調(diào)節(jié)作用。

Fig 4 Effects of Sal B,Rg1 and R1 (10 μmol·L-1) on calcium concentration of OGD/R injured astrocytes detected by flow cytometry *P<0.05 vs con;#P<0.05 vs OGD/R.

2.7 Sal B、Rg1、R1對OGD/R損傷星形膠質(zhì)細胞PI3K、AKT、STAT3蛋白磷酸化的影響現(xiàn)已有研究表明，抑制PI3K/Akt信號通路的激活能增加大鼠的超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛水平，降低氧化應激損傷。STAT3缺失的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生高水平的ROS，導致細胞死亡增加。本研究探討了Sal B、Rg1、R1對受損星形膠質(zhì)細胞PI3K/AKT、STAT3機制的調(diào)節(jié)。如Fig 6A-B所示，與con組比較，OGD/R組膠質(zhì)細胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平低(P<0.05)，與OGD/R組相比Sal B、Rg1、R1可明顯升高p-AKT蛋白的表達(P<0.05)。如Fig 6C所示，與con組相比，OGD/R組STAT3蛋白磷酸化水平降低(P<0.05)；與OGD/R組相比，Sal B、Rg1(10 μmol·L-1)能升高OGD/R損傷后STAT3蛋白磷酸化水(P<0.05)。

3 討論

腦卒中是全球第二大死亡原因，是一種有極高致殘率和致死率的腦血管疾病，缺血性腦卒中占比85%[10]。星形膠質(zhì)細胞數(shù)量龐大，約占腦細胞的一半，是膠質(zhì)細胞中最豐富的亞型[11]。目前，關于星形膠質(zhì)細胞在腦卒中中的研究越來越多，有望成為治療腦卒中的重要靶點。

Fig 5 Effects of Sal B,Rg1 and R1 (10 μmol·L-1) on mRNA expression of BDNF,NGF and IGF1α in astrocytes injured by OGD/R )**P<0.01 vs con;#P<0.05，##P<0.01 vs OGD/R.

Fig 6 Effects of Sal B,Rg1 and R1 (10 μmol·L-1) on phosphorylation of STAT3,PI3K,AKT protein in astrocytes injured by *P<0.05，**P<0.01 vs con；#P<0.05，##P<0.01 vs OGD /R.

現(xiàn)已有大量關于丹參及三七的研究報道，部分研究關于其活性成分Sal B、Rg1、R1，王國軍等[12]研究表明，Sal B可通過減輕缺血/再灌注模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，使大鼠腦組織梗死體積減小，提高大鼠腦組織中SOD、CAT、GSH-Px等的活力而起到腦保護作用；林超等[13]通過體外實驗證明，Sal B對氧自由基有清除作用，從而發(fā)揮抗氧化作用；有研究發(fā)現(xiàn)Rg1也可通過提高細胞內(nèi)抗氧化酶的表達來增強抗氧化能力進而降低ROS的產(chǎn)生和線粒體膜去極化[14]；Meng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，R1可通過抗細胞凋亡和氧化減小腦梗死面積，發(fā)揮腦保護作用。以前期研究為基礎，我們進一步探討Sal B、Rg1、R1在受損星形膠質(zhì)細胞保護方面是否也發(fā)揮作用。

STAT3作為ROS重要的調(diào)控因子，我們對其進行了研究，發(fā)現(xiàn)Sal B、Rg1、R1可以通過STAT3信號通路調(diào)控細胞內(nèi)ROS水平，降低氧化損傷。研究表明，PI3K/AKT信號通路通過磷酸化激活下游相關生存蛋白在神經(jīng)保護中起著重要作用[16]，我們關于Sal B、Rg1、R1對受損星形膠質(zhì)細胞的保護作用機制也進行了探討，發(fā)現(xiàn)OGD/R可使細胞PI3K、AKT蛋白磷酸化水平降低，Sal B、Rg1、R1可顯著提高AKT蛋白磷酸化水平，由于信號通路是一個級聯(lián)放大的過程，我們推測Sal B、Rg1、R1通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮保護星形膠質(zhì)細胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Sal B、Rg1、R1通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT、STAT3信號通路降低OGD/R損傷后星形膠質(zhì)細胞ROS的釋放量，降低由ROS升高引起的鈣超載及線粒體功能障礙，發(fā)揮星形膠質(zhì)細胞保護作用，增加受損星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，可能進一步對神經(jīng)發(fā)揮保護作用。但是結(jié)果顯示Sal B和Rg1、R1的作用具有差異性，提示我們不同活性成分可能通過同一或不同的作用途徑發(fā)揮療效。