楊澤岸，陳 晨，張 媛，王 燦，高 華，吳彥霖

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 北京 102629 2.上海食品藥品檢驗(yàn)所,上海 201203)

疫苗質(zhì)量安全問(wèn)題也日益受到公眾關(guān)注，其中熱原反應(yīng)(pyrogen reaction)是臨床常見的不良反應(yīng)之一。熱原反應(yīng)系經(jīng)非腸道給藥0.5～1 h內(nèi)出現(xiàn)的冷顫、高熱、出汗、昏暈、嘔吐，甚至休克等現(xiàn)象，能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)稱為熱原[1]。熱原包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。藥物中的熱原物質(zhì)主要指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌外壁及內(nèi)毒素(endotoxin)。細(xì)菌內(nèi)毒素，又稱脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，是革蘭陰性菌的產(chǎn)物，其致熱能力最強(qiáng)[2]。熱原檢查方法包括家兔熱原檢查法(rabbit pyrogen test，RPT)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(bacterial endotoxin test，BET)和單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)(monocyte activation assay，MAT)[3-9]。

基于ISO 17025 的規(guī)范性文件中關(guān)于方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容，各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的指導(dǎo)原則提出了方法驗(yàn)證(method validation)、方法轉(zhuǎn)移(method transfer)和方法確認(rèn)(method verification)的概念，用于保證檢驗(yàn)方法適合于檢驗(yàn)、被檢樣品的質(zhì)量可控，并確保檢驗(yàn)人員有能力去操作方法，根據(jù)目的、檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)環(huán)境等因素的不同，以上3個(gè)概念的內(nèi)涵和側(cè)重點(diǎn)又有所不同。method validation的核心是實(shí)驗(yàn)室通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)試，證明被驗(yàn)證的方法適用于該方法擬定的檢測(cè)用途。method validation主要由方法建立者進(jìn)行，方法建立者必須要證明所建立的方法能夠滿足期望的檢測(cè)用途。method transfer是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立了經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法，當(dāng)其他實(shí)驗(yàn)室(方法接收實(shí)驗(yàn)室)在使用這個(gè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)檢測(cè)時(shí)，就牽涉到方法在2個(gè)及以上不同實(shí)驗(yàn)室之間的轉(zhuǎn)移問(wèn)題，接收方法的實(shí)驗(yàn)室需要證明其能夠成功地在本實(shí)驗(yàn)室中運(yùn)行該方法。常見的method transfer有：分析方法由公司的研發(fā)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室[10-12]。在方法的協(xié)作標(biāo)定過(guò)程中，協(xié)作單位接收組織者提供的HL-60-IL-6單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)方法[13-14]，并基于組織者的要求進(jìn)行方法關(guān)鍵指標(biāo)的測(cè)試和研究，協(xié)助完成方法的建立和驗(yàn)證，上述環(huán)節(jié)涉及method transfer和method validation兩個(gè)環(huán)節(jié)。因此，我們首先按照組織者要求對(duì)LPS刺激HL-60分泌IL-6法進(jìn)行了方法的transfer和validation，并使用經(jīng)過(guò)validation的方法進(jìn)行了人狂犬疫苗的品種適用性研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑細(xì)胞：人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞及鑒定結(jié)果由上海藥檢所提供[16]。

試劑：胎牛血清、IMDM、胰酶(Gibco公司，批號(hào)1347556、1897074、1095511)；人白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(BD OptEIATM公司，批號(hào)7118747EU；R&D公司，批號(hào)P134546；欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)H170523-003a和H190716-007a)；LPS國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)150800-201601)；凍干人用狂犬病疫苗：10個(gè)廠家13批及熱原不合格樣品對(duì)應(yīng)的3批疫苗附的注射用水(16批樣品)。

1.2 主要儀器CKX 41倒置顯微鏡(Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；6R離心機(jī)(Beckman Coulter公司)：Z2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Beckman Coulter公司)；SYNERGY MX和SYNERGY HT酶標(biāo)儀(Biotek公司)。

1.3 方法

1.3.1方法轉(zhuǎn)移 1)LPS 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 在無(wú)菌條件下，將LPS國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶至10 000 EU·mL-1，在渦旋混合器上混勻15 min，用維持培養(yǎng)液稀釋成0，0.015 6，0.031 2，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1.0，10，100 EU·mL-1一系列濃度，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30 s。2)細(xì)胞檢測(cè)體系的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，穩(wěn)定傳代2～3次，調(diào)整HL-60細(xì)胞密度至每1 mL約含1.0×105～1.0×106個(gè)細(xì)胞，于20%胎牛血清的IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。選擇8～20代次的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞懸液適量，1 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，用維持培養(yǎng)液(含2%FBS的IMDM培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞密度為每1 mL約含1.0×106個(gè)細(xì)胞，100 μL每孔接種于96孔U型板，加入100 μL 3.1或供試品溶液，平行3孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，取細(xì)胞上清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6含量，計(jì)算450 nm處的吸光度A值與LPS濃度的關(guān)系，即為HL-60 MAT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體系。

1.3.2方法驗(yàn)證 參考2015年版《中國(guó)藥典》四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，對(duì)方法的線性及范圍、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、耐用性進(jìn)行驗(yàn)證[17]。

1)線性 以LPS濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A值為縱坐標(biāo)進(jìn)行四參數(shù)擬合。R2不得低于0.95，計(jì)算該體系對(duì)應(yīng)的最低檢測(cè)限。最低檢測(cè)限=空白孔實(shí)測(cè)平均A值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(+3 s)。

2)重復(fù)性 取1名人員3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3次最低檢測(cè)限結(jié)果應(yīng)不超過(guò)50%～200%。

3)準(zhǔn)確度 在維持培養(yǎng)基中加入接近反應(yīng)曲線 EC50的LPS濃度溶液作為添加已知的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，配制方法同3.2，計(jì)算回收率%。

回收率%=(實(shí)測(cè)值-溶液中所含被測(cè)成分值)/加入標(biāo)準(zhǔn)品量×100%

4)耐用性 細(xì)胞自購(gòu)買起為1代，建庫(kù)留種，取8、16、21和24代細(xì)胞進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，考察指標(biāo)為最低檢測(cè)限；考察2家公司的IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.3.3凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 選用10個(gè)廠家共計(jì)13批次樣品，對(duì)其中RPT和BET檢測(cè)不合格的樣品附帶的注射用水3批進(jìn)行檢查，按照《中國(guó)藥典》品種項(xiàng)下進(jìn)行最大稀釋倍數(shù)MVD的計(jì)算，按照公式L=K·M-1，確定供試品的熱原物質(zhì)限值(L)。其中，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU·(kg·h)-1表示，注射劑K=5 EU·(kg·h)-1，M為人用每千克體重的最大供試品劑量，以mL·(kg·h)-1、mg·(kg·h)-1或U·(kg·h)-1表示，中國(guó)人均體重按60 kg計(jì)算，人體表面積按1.62 m2計(jì)算。注射時(shí)間若不足1 h，按1 h計(jì)算。按照L按照標(biāo)準(zhǔn)每劑不得大于25EU，規(guī)格為0.5 mL和1.0 mL。按照公式MVD=C·L/·λ-1，λ為檢測(cè)體系的最低檢測(cè)限，每一步稀釋比不得大于1 ∶10，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30秒[18]。

1.3.4細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)顯色測(cè)定法 按《中國(guó)藥典》四部(2015 版)[18]通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法項(xiàng)中光度測(cè)定法進(jìn)行凍干人用狂犬病疫苗的細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)。

1.3.5熱原檢查法按《中國(guó)藥典》四部(2015 版)[19]通則1142熱原檢查法項(xiàng)進(jìn)行凍干人用狂犬病疫苗的熱原檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1線性 當(dāng)LPS濃度為0、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、10、100 EU·mL-1時(shí)，致HL-60細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-6含量的吸光度A值通過(guò)logistic四參數(shù)回歸，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系(Fig 1)，R2值均>0.95。

Fig 1 Dose-response relationship of IL-6 secretion byHL-60 induced by different concentrations of LPS standard

2.1.2重復(fù)性 使用BD OptEIATM公司和R&D公司生產(chǎn)的人IL-6 ELISA試劑盒分別進(jìn)行3次試驗(yàn)，計(jì)算R2值和最低檢測(cè)限。2個(gè)廠家吸光度A值差異比較大，但通過(guò)試劑盒自帶標(biāo)曲計(jì)算IL-6含量，2個(gè)廠家對(duì)IL-6含量的檢測(cè)一致。表明HL-60-IL-6檢測(cè)體系重復(fù)性符合1.3.2要求，最低檢測(cè)限的波動(dòng)范圍在50%～200%之間(Tab 1)。

Tab 1 Linearity and repeatability(n=3，3 independent experiments for 2 manufacturers)

2.1.3準(zhǔn)確度 將LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1作為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入檢測(cè)體系，平行6孔，獨(dú)立進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體系的LPS含量為0 EU·mL-1，實(shí)測(cè)值為0.01 EU·mL-1(Tab 2)，LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1的回收率在91%～110%。

2.1.4耐用性 參考重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在比對(duì)了BD OptEIATM公司和R&D公司生產(chǎn)的人IL-6 ELISA試劑盒檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行欣博盛生物科技有限公司2個(gè)批號(hào)的人IL-6 ELISA試劑盒檢測(cè)，通過(guò)logistic四參數(shù)回歸，LPS濃度與HL-60分泌IL-6含量呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系，R2值均>0.95，最低檢測(cè)限為0.5和1.0 EU·mL-1，靈敏度與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相比無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)。

Tab 2 Accuracy test results n=6，5 independent experiments for 2 concentrations)

使用R&D公司比較了8、16、20和24代的細(xì)胞的靈敏度，24代細(xì)胞與8代細(xì)胞的吸光度A值相比降低超過(guò)80%，最低檢測(cè)限分別為0.0625、0.0625、0.5和10 EU·mL-1，且24代細(xì)胞0.5、1.0和10 EU·mL-1劑量組間差異無(wú)顯著性，基于此，檢測(cè)體系建議使用20代次以內(nèi)的HL-60細(xì)胞用于單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

2.2 凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)《中國(guó)藥典》2015年版二部?jī)龈扇擞每袢∫呙缙贩N項(xiàng)下規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素含量不得超過(guò)25 EU·劑-1，檢測(cè)體系最低檢測(cè)限為0.125 EU·mL-1，參照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中光度測(cè)定法中的干擾試驗(yàn)，以1.0 EU·mL-1作為干擾濃度，計(jì)算檢測(cè)樣品中的LPS含量(Tab 2)。編號(hào)14-16為BET檢驗(yàn)不合格樣品附帶安瓿裝水，表明HL-60-IL-6法、BET法和RPT法檢測(cè)結(jié)論一致。

3 討論

3.1 熱原補(bǔ)充方法的研究為了確保非腸道用藥的質(zhì)量和安全，尤其是靜脈注射用藥，熱原檢測(cè)技術(shù)日益至關(guān)重要，各國(guó)藥典也相繼收載多種熱原檢測(cè)方法，包括家兔熱原檢查法、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)。RPT被認(rèn)為是檢測(cè)熱原的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可全面、直觀反應(yīng)藥物的臨床風(fēng)險(xiǎn)，其缺點(diǎn)是不能定量、靈敏度低、結(jié)果重復(fù)性差、費(fèi)用較高、使用活體動(dòng)物等，且RPT不適用于放射性藥物、化療藥物、免疫抑制劑等影響家兔發(fā)熱藥物的熱原檢測(cè)。BET可半定量或定量檢測(cè)藥物中細(xì)菌內(nèi)毒素(含量，靈敏度較高，重復(fù)性好，其缺點(diǎn)是只能檢測(cè)革蘭陰性菌來(lái)源的LPS，不能檢測(cè)其他來(lái)源的熱原[15]。目前，《英國(guó)藥典》、《歐洲藥典》均已收錄了MAT，用于熱原檢測(cè)，于2005、2006年已有7種方法分別得到歐洲權(quán)威機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證：7種推薦的方法有人全血法(新鮮人全血-IL-1β、新鮮人全血-IL-6和凍存人全血-IL-1β)，人外周血法(PBMC-IL-6)和細(xì)胞系法(MM6-IL-6、THP1-新喋呤(Neo)、THP1-TNFα)[17]。其中，人全血和人外周血對(duì)人血的要求較高，而且來(lái)源困難。而細(xì)胞系法中推薦的兩株細(xì)胞MM6和THP-1-新喋呤(Neo)細(xì)胞無(wú)法獲得，限制了該方法的推廣應(yīng)用。

Tab 3 Results of freeze-dried human rabies vaccine HL-60-IL-6 method，BET method and RPT method

此外，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法須使用專用試劑—鱟試劑系從國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物鱟體內(nèi)血液提取，由于環(huán)境惡化、過(guò)度捕撈(提取鱟試劑是捕撈鱟的主要目的之一)等原因，使我國(guó)鱟資源銳減，因而對(duì)鱟資源的保護(hù)迫在眉睫[16]。本實(shí)驗(yàn)所采用的HL-60細(xì)胞系人源細(xì)胞，不再使用鱟、家兔等動(dòng)物，消除了種屬差異，可作為熱原物質(zhì)檢查方法的有力補(bǔ)充。HL-60-IL-6單核細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)對(duì)凍干人用狂犬病疫苗樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以對(duì)熱原進(jìn)行定量檢測(cè)。且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該法不僅用于LPS檢測(cè)，還可用于革蘭氏陽(yáng)性菌脂磷壁酸，真菌酵母多糖類熱原物質(zhì)的檢測(cè)，具有廣譜檢測(cè)多種熱原的能力，亦可避免使用人血或單核細(xì)胞所產(chǎn)生的倫理問(wèn)題，從而更好地保障凍干人用狂犬病疫苗的臨床用藥安全，盡可能減少因熱原污染導(dǎo)致的不良反應(yīng)。

3.2 方法協(xié)作標(biāo)定的研究一個(gè)方法的研究從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證開始，到實(shí)驗(yàn)室間轉(zhuǎn)移和再驗(yàn)證完成，經(jīng)由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同人員對(duì)方法進(jìn)行研究。對(duì)于方法協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室在接收到方法時(shí)，涉及的再驗(yàn)證項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考核指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)、符合要求評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)等具體問(wèn)題，我國(guó)尚無(wú)明確規(guī)定。大多數(shù)方法協(xié)作標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)室均基于2015年版《中國(guó)藥典》四部通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法的再次驗(yàn)證或部分驗(yàn)證[17]。國(guó)家藥典委員會(huì)進(jìn)行了關(guān)于《中國(guó)藥典》2020年版四部通則增修訂內(nèi)容(第十九批)的公示，在《分析方法轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則》公示稿中規(guī)定：“對(duì)分析方法轉(zhuǎn)移的可接受方法還包括再驗(yàn)證或部分驗(yàn)證。再驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)對(duì)通則9101《分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中收載的可能在轉(zhuǎn)移中受到影響的驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行說(shuō)明”。有望在《中國(guó)藥典》2020年版四部通則中增加《分析方法轉(zhuǎn)移指導(dǎo)原則》，為相關(guān)的方法協(xié)作標(biāo)定研究提供了理論指導(dǎo)和支持。