陳雯雯，拜 年，管 娜，譙 明，張浩科

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830054)

高脂血癥是血漿中的甘油三酯、膽固醇以及高密度脂蛋白過低或低密度脂蛋白水平過高的一種代謝異常性的疾病。其主要與先天脂質(zhì)代謝缺陷、環(huán)境因素、不良生活習(xí)性有關(guān)，或由其他疾病引起。高脂血癥是許多疾病的危險因素，最常見的是高血壓、冠心病等心血管疾病。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計[1-3]，近年來我國成人的高脂血癥發(fā)病率持續(xù)增加，且患病群體也逐漸年輕化，青少年血脂異常疾病也正在加重，合理地控制血脂水平、預(yù)防高脂血癥尤為重要。黃連(CoptidisRhizoma)是毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖[4]。黃連的主要成分為小檗堿、黃連堿、表小檗堿、甲基黃連堿、巴馬汀等生物堿，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效，臨床上主要用于降血糖、降血脂、腹瀉、抗炎、抗病原體、抗細(xì)菌毒等的治療[5-8]。有研究通過建立大鼠高脂血模型、小鼠高脂血模型和高脂兔模型，均驗證了小檗堿可調(diào)節(jié)動物體內(nèi)的血脂水平，改善總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇等[9-11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接探討黃連治療高脂血癥的作用機制，為黃連治療高脂血癥奠定更多的臨床依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1黃連中目標(biāo)化合物的篩選借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索黃連中含有的化學(xué)成分，設(shè)置限制條件為口服藥物利用度(OB)≥30，類藥性(DL)≥0.18，得到黃連的目標(biāo)活性成分，同時檢索相關(guān)文獻進行補充。再通過PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取化合物SMILES號。

1.2黃連活性成分作用靶點的檢索使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)和TargetNet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com)，檢索獲得黃連活性成分相關(guān)的作用靶點。將每種成分的作用靶點以表格形式保存至EXCEL中。運用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)獲取作用靶點的基因。

1.3高脂血癥相關(guān)靶點的獲取以高脂血癥“Hyperlipemia”“Hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞，應(yīng)用OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.mim.org)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(http://go.drugbank.com)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org)檢索獲得高脂血癥疾病的靶點。

1.4黃連與高脂血癥交集靶點的匯總將化合物靶點和疾病靶點輸入Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/ venny)中，匯總交集基因并繪制韋恩圖。

1.5藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的繪制通過Cytoscape 3.8.2軟件(http://www.cytoscape.org)，繪制“黃連-成分-靶點-高脂血癥” 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選出的交集基因利用STRING(http://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cystoscap 3.8.2軟件以Degree平均值作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進行關(guān)鍵靶點的篩選。

1.7靶基因GO和KEGG代謝通路富集分析利用R軟件和Bioconductor工具包，進行關(guān)鍵靶基因GO與KEGG代謝通路富集分析。

1.8分子對接驗證采用分子對接完成黃連主要活性成分與核心靶點的結(jié)合模式預(yù)測。對接采用AutoDock Vina軟件完成。對接前選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前三的作為核心靶點，從PDB 數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取核心靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)。主要活性成分的3D結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫下載獲得，并使用Chem3D軟件在MMFF94力場對小分子進行能量最小化。使用PyMol 2.5軟件進行去加氫、除水分子以及非配體小分子等。隨后定義對接盒子，使其包裹蛋白活性口袋。使用ADFRsuite 1.0將PDB格式的小分子以及受體蛋白轉(zhuǎn)換為PDBQT格式。最后進行分子對接，構(gòu)象搜索詳盡度設(shè)為32，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。輸出的親和力打分最高的構(gòu)象作為正確構(gòu)象，并使用PyMol 2.5對其進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1黃連活性成分及靶點篩選經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選共得到黃連中14個潛在活性成分，具體結(jié)果見表1。使用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫和TargetNet數(shù)據(jù)庫檢索并剔除重復(fù)靶點，獲得黃連活性成分對應(yīng)的464個作用靶點。

表1 黃連中14個潛在活性成分

續(xù)表1:

2.2高脂血癥作用靶點篩選通過檢索GeneCards 、Drugbank、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲得高脂血癥疾病靶點1554個。

2.3黃連-高脂血癥交集靶點篩選運用Venny2.1軟件，將獲得的藥物靶點和疾病靶點制作韋恩圖，共得到138個交集靶點，見圖1。

2.4黃連-成分-靶點-高脂血癥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析通過Cystoscap 3.8.2軟件繪制“黃連-成分-靶點-高脂血癥”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。圖中“HL”代表“黃連”，綠色代表黃連中的13種活性成分，其中刪除1種與疾病靶點無關(guān)聯(lián)的活性成分“Corchoroside A_qt”，藍色代表138個共同靶點，“Hyperlipemia”代表“高脂血癥”。

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點分析利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建黃連-高脂血癥共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中包含138個節(jié)點，1 250條邊，平均節(jié)點18.1，見圖3。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap中，以Degree值大于平均值的基因作為核心靶點，選取前30個靶點繪圖，見圖4。主要靶點有AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、CCND1、ESR1、HSP90AA1、ERBB2、MMP9、SIRT1等。

2.6GO功能富集分析GO富集分析結(jié)果得到生物學(xué)過程通路共1 630條、細(xì)胞組分表達過程共63條，分子功能相關(guān)過程共124條，見圖5-7。生物學(xué)過程主要涉及regulation of lipid metabolic process、cellular response to peptide、epithelial cell proliferation、regulation of small molecule metabolic process和aging等方面；細(xì)胞組分主要涉及membrane raft、membrane microdomain、membrane region、apical part of cell和apical plasma membrane等方面；分子功能主要涉及endopeptidase activity、protein serine/threonine kinase activity、serine hydrolase activity、serine-type endopeptidase activity和serine-type peptidase activity等。

2.7KEGG通路富集分析將KEGG通路分析結(jié)果中的前20條通路進行繪圖，見圖8。主要包括以下通路：癌癥中的蛋白多糖、化學(xué)致癌作用-受體激活、內(nèi)分泌抵抗、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、胰島素信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、乳腺癌、AMPK信號通路、甲狀腺激素信號通路、胰腺癌、ErbB信號通路、催乳素信號通路、非小細(xì)胞肺癌、EGFR 抗酪氨酸激酶抑制劑、膠質(zhì)瘤、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)、Fc epsilon RI信號通路，其中主要涉及高脂血癥相關(guān)的通路有5條，見表2。

表2 黃連治療高脂血癥的交集靶點的KEGG信號通路

2.8分子對接分析對接模擬技術(shù)是探究小分子與目標(biāo)靶點相互作用的便捷有效手段。通過使用AutoDock Vina軟件對Degree值排名前三的活性成分Obacunone(黃柏酮)、Quercetin(槲皮素)、Moupinamide(穆坪馬兜鈴酰胺)與核心靶點AKT1、TNF、EGFR進行對接研究，結(jié)果見表3。結(jié)合親和力為負(fù)數(shù)表示存在結(jié)合的可能，通常數(shù)值小于-6.0 kcal/mol被認(rèn)為結(jié)合可能性較大。如表3所示，對接獲取了9組復(fù)合物的結(jié)合能，所有結(jié)合的結(jié)合能打分?jǐn)?shù)值都在-6.0kcal/mol以下，表明這些組合結(jié)合較好。其中Obacunone-AKT1、Moupinamide-EGFR、Moupinamide-TNF為結(jié)合最佳的三組復(fù)合物，結(jié)合能在-9.0 kcal/mol以下，表明該三個組合極其重要，見圖9。圖中左側(cè)為整體視圖，右側(cè)為局部視圖，藍色stick為小分子，淡青色cartoon為蛋白，黃色虛線表示氫鍵作用，灰色虛線表示疏水作用，綠色虛線表示π-π共軛作用。圖9A小分子Obacunone與AKT1蛋白的相互作用模式，小分子主要通過疏水作用以及氫鍵作用和蛋白發(fā)生作用，如小分子和蛋白上的V164、F161、D292形成疏水作用，和L295、G294、G159形成氫鍵作用。圖9B小分子Moupinamide與EGFR蛋白上的L844、A743、V726、L777、M766形成疏水作用，與C797、K745形成氫鍵作用，此外還與蛋白上的F856形成π-π共軛作用。圖9C小分子Moupinamide與TNF蛋白的結(jié)合復(fù)合物，從圖中可以看到Moupinamide結(jié)合在TNF蛋白的三元復(fù)合物中間的活性空腔當(dāng)中。小分子主要通過疏水作用、π-π共軛作用、陽離子π共軛作用以及氫鍵作用和蛋白發(fā)生作用，如小分子和蛋白上的L133、L135、Y227、V199、L233、K87形成疏水作用，和L233、Y227、S85形成氫鍵作用，和K87形成陽離子π共軛作用，和Y135形成π-π共軛作用。綜上所述，經(jīng)過分子對接驗證，活性成分黃柏酮、槲皮素、穆坪馬兜鈴酰胺與AK1、TNF、EGFR核心靶點顯示出較好的結(jié)合能力。

表3 核心成分與核心靶點分子對接

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討了黃連治療高脂血癥的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連中黃柏酮、槲皮素、穆坪馬兜鈴酰胺、表小檗堿、掌葉二蒽酮、氧化小檗堿、R-氫化小檗堿、巴馬汀、小檗堿、廣玉蘭內(nèi)酯、小檗紅堿、甲基黃連堿、黃連堿等活性成分在黃連的藥理作用降血脂中較為關(guān)鍵，但本研究對于黃連中其他活性成分的研究還不夠全面，應(yīng)進行更深度地挖掘探討或者成分的配伍預(yù)測。黃連活性成分治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點有蛋白激酶(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子受體(EGFR)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)、雌激素受體1(ESR1)、HSP90AA1、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、SIRT1等。AKT蛋白激酶家族包括3種亞型：AKT1/2/3或PKBα/β/γ，而AKT1主要在大部分組織中表達。AKT是胰島素調(diào)節(jié)途徑所必須的，可控制葡萄糖和脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，包括葡萄糖在相關(guān)組織中的轉(zhuǎn)運，肝臟的糖異生、脂解調(diào)節(jié)和肝臟脂肪生成。激活的AKT1可以提高磷酸化活性或下游蛋白的活性如GSK-3β和PDE3，并最終調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪的代謝[12-13]。TNF主要由活化的巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其中TNF-α占主要作用。TNF家族蛋白水平已經(jīng)在高脂血癥相關(guān)疾病中作為重要的參考指標(biāo)[14]。EGFR參與了許多人類疾病，在調(diào)節(jié)生存、各種組織的增殖、遷移和分化方面起著核心作用，有研究表明EGFR與代謝紊亂相關(guān)，通過減少膽固醇的合成以及增強脂肪酸氧化來減少脂肪積累和肝細(xì)胞損傷，EGFR可能是治療血脂異常的潛在靶點[15]。ESR1是雌激素受體的主要類型之一，ESR1的基因多態(tài)性在脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用[16]。MMP9作為高脂血癥患者血清指標(biāo)之一，可進行血脂調(diào)節(jié)[17]。

KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示黃連治療高脂血癥主要是通過AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、AMPK信號通路、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)。研究表明AGE-RAGE信號通路涉及高脂血癥和動脈粥樣硬化等疾病[18]。TNF信號通路與高脂血癥及動脈粥樣硬化息息相關(guān)，TNF-α可通過抑制游離脂肪酸吸收、抑制脂肪形成和分化、同時降低脂蛋白酶活性并增加激素敏感脂酶的活性來加速脂肪的分解[19]。TNF-α還可通過內(nèi)皮細(xì)胞直接增加低密度脂蛋白顆?？缂?xì)胞轉(zhuǎn)運作用發(fā)揮其促動脈粥樣硬化作用。流體剪切應(yīng)力可刺激血管活性物質(zhì)釋放和改變基因的表達，其可增加血液中促動脈粥樣硬化成分的相互作用活化內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)流體剪切應(yīng)力損傷降低，脂質(zhì)會相應(yīng)的增加。AMPK可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡，參與調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、產(chǎn)熱和脂肪組織的發(fā)育。激活的AMPK通過磷酸化乙酰輔酶A羧化酶和降低丙二酰輔酶A水平來抑制脂肪酸合成和促進脂肪酸氧化[20-21]，黃連中的活性成分小檗堿可通過激活A(yù)MPK發(fā)揮降脂作用。脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，通過整合多種多樣的激素和生化信號來控制，這些信號集中在脂肪細(xì)胞上，以調(diào)節(jié)脂肪酶和非酶輔助蛋白的功能。脂解的主要調(diào)節(jié)因子包括脂解激活劑胰高血糖素和兒茶酚胺，以及抗脂解劑胰島素。另外，飲食成分也可能調(diào)節(jié)脂肪分解，包括膳食鈣、酒精和咖啡因。

綜上所述，黃連對治療高脂血癥具有多成分-多靶點-多通路的作用特點。本研究通過數(shù)據(jù)庫檢索并以化合物的藥動學(xué)參數(shù)中口服藥物利用度和類藥性為限制條件，獲得黃連中主要的活性成分，結(jié)果可能不夠全面，藥物通過不同的給藥途徑如注射或外用給藥等，在體內(nèi)的吸收程度差異也較大，不應(yīng)只關(guān)注口服藥物利用度高的活性成分。同時檢索出的活性成分沒有體內(nèi)血藥濃度的測定，不能說明其為藥效成分發(fā)揮治療作用，并且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要依托于數(shù)據(jù)庫的檢索，目前所應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫具有局限性，結(jié)果存在偏差，中藥成分較為復(fù)雜，尚需要更進一步通過體外細(xì)胞或者動物實驗手段來驗證活性成分。未來網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫在不斷地完善和更新下，將會更精準(zhǔn)的闡述中藥的有效成分、作用機制、藥理毒理等方面，為今后中藥的廣泛應(yīng)用提供更全面的臨床依據(jù)。