吳 競，劉 燦，王科文

[1.碩騰（上海）企業(yè)管理有限公司，上海 長寧 200050；2.碩騰生物制藥有限公司，江蘇 蘇州 215127]

聯(lián)合疫苗是指將多種活的或滅活的微生物以及抗原成分聯(lián)合配制而成的疫苗，能夠預防不同病原微生物引起的多種疾病或同一種病原微生物的不同血清型引起的疾病。在聯(lián)合疫苗研發(fā)的過程中，需充分考慮組分間的相容性、非活性成分對聯(lián)合疫苗的影響、佐劑對聯(lián)合疫苗的影響以及聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性和有效期。聯(lián)合疫苗的使用能簡化免疫程序、提高接種人員的依從性以及降低疫苗的管理成本[1]。豬圓環(huán)和支原體的聯(lián)合疫苗是近年來豬用疫苗中設計和研發(fā)的熱點，從全國獸用生物制品批簽發(fā)數(shù)量來看，圓支二聯(lián)苗是市場對圓環(huán)疫苗和支原體疫苗更依賴的選擇。2021年3月10日，碩騰公司的瑞圓舒?（豬圓環(huán)病毒1-2型嵌合體、支原體肺炎二聯(lián)疫苗）正式獲得中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準，成為我國首個獲批的“即用型”豬用圓環(huán)支原體二聯(lián)進口疫苗。瑞圓舒?適用于3周齡或3周齡以上的健康豬，用于預防豬圓環(huán)病毒2型引起的感染，減少因豬肺炎支原體感染引起的肺炎。瑞圓舒?自2013年在美國首次上市以來，其使用的安全性、經(jīng)濟性、有效性在全球范圍內(nèi)得到了廣泛而充分的驗證。本文介紹瑞圓舒?獨特的研發(fā)和工藝特點，旨在分析其提升豬群健康福利，幫助養(yǎng)殖企業(yè)創(chuàng)造經(jīng)濟價值背后蘊含的科技價值。

1 豬圓環(huán)病毒1-2型嵌合體

在商品化的豬圓環(huán)支原體聯(lián)合疫苗中，對于圓環(huán)抗原組分，通常選擇豬圓環(huán)病毒2型的全病毒滅活抗原或者亞單位抗原（大腸桿菌表達系統(tǒng)或重組桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的Cap蛋白）。不同的是，瑞圓舒?選擇了豬圓環(huán)病毒1-2型嵌合體病毒滅活抗原。

豬圓環(huán)病毒（porcinecircovirus, PCV）歸屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種無囊膜單股共價環(huán)狀DNA病毒，已發(fā)現(xiàn)4種PCV類型，分別為PCV1、PCV2、PCV3和PCV4，其中PCV3和PCV4尚未正式列入圓環(huán)病毒屬[2]。PCV1首次在PK-15細胞的污染物中發(fā)現(xiàn)，無致病性。PCV2引起豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus disease, PCVD），PCVD有不同的臨床表現(xiàn)，包括豬圓環(huán)病毒2型系統(tǒng)性疾?。≒CV2-SD）、豬圓環(huán)病毒2型繁殖性疾?。≒CV2-RD）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）和亞臨床感染。PCV2基因組由11個推測的開放閱讀框（ORFs）排列組成，但只有4個用于蛋白質(zhì)的表達。ORF1和ORF2分別是PCV2基因組中兩個最大的ORF，ORF1編碼非結構復制酶Rep和Rep'蛋白，主要功能為參與病毒的復制；ORF2編碼唯一的結構蛋白（衣殼蛋白，Cap蛋白），該結構蛋白具有良好的免疫原性，是基因工程疫苗首選的目的基因。PCV1不同毒株之間或PCV2不同毒株之間的基因組序列同源性一般都超過90%，而PCV1和PCV2的同源性僅有68%～76%[3]。

2003年，F(xiàn)enaux等首次報道了PCV1-2嵌合體病毒的構建[4]，并評估了PCV1-2嵌合體病毒的免疫原性和致病性。在該研究中，以不致病的PCV1基因組為骨架，用PCV2的ORF2基因替換PCV1的ORF2基因，構建成PCV1-2嵌合體病毒。體外試驗表明，PCV1-2和PCV1、PCV2一樣，都能在PK15細胞上復制；動物試驗表明，PCV1-2嵌合體病毒能夠誘導機體產(chǎn)生特異性的抗體，產(chǎn)生較低的組織病理損傷、病毒血癥、淋巴組織中的抗原定植（類似于非致病性PCV1的感染）。隨后在2004年，F(xiàn)enaux等評價了減毒的PCV1-2嵌合體病毒對PCV2病毒的免疫攻毒保護作用[5]，試驗分為4組，第1組試驗豬通過肌肉注射接種PCV1-2的感染性克隆，第2組試驗豬通過淋巴注射接種PCV1-2的感染性克隆，第3組試驗豬通過肌肉注射接種103.5 TCID50的PCV1-2病毒，第4組試驗豬為對照組；接種42 d后，對各組試驗豬用PCV2攻毒。結果顯示，攻毒21 d后，1～3組的試驗豬沒有檢測到病毒血癥，對照組試驗豬則能檢測到，且相對于對照組，1～3組的試驗豬中只檢測到輕微的PCV2淋巴結病毒定植、淋巴組織耗竭和組織細胞替換，說明PCV1-2的感染性克隆或病毒能夠誘導針對PCV2感染的保護性免疫，該研究為PCV2疫苗的設計和研發(fā)提供了潛在策略。

雖然Gillespie等[6]的研究表明，PCV1-2嵌合體病毒在PK-15細胞上連續(xù)傳代11次或在豬只體內(nèi)連續(xù)傳代3次后仍然保持高度的遺傳穩(wěn)定性，但在Hemann等[7]的研究中，用滅活的PCV1-2嵌合體疫苗和PCV1-2嵌合體活疫苗接種母豬，隨后用PCV2精液攻毒，結果顯示：滅活的PCV1-2嵌合體疫苗能誘導更好的抗體水平；兩種免疫策略都能幫助母豬很好地控制PCV2病毒血癥，母豬的PCV2病毒血癥水平和持續(xù)時間在兩組之間沒有顯著差異，而相比于對照組，兩組母豬后代中檢測到的PCV2水平都顯著降低。Li等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，PCV1-2b嵌合體的滅活疫苗和活疫苗都能對PCV2b的感染產(chǎn)生保護性免疫。因此，滅活的PCV1-2嵌合體疫苗在保證有效性的同時，也保證了疫苗的安全性。

PCV2病毒在培養(yǎng)細胞上滴度的提升是PCV2全病毒疫苗研發(fā)和工藝上的難題之一。Beach等[9]的研究表明，相比于PCV2，PCV1-2嵌合體病毒感染PK-15細胞96 h后，產(chǎn)生了至少10倍多的感染性病毒，說明了PCV1-2嵌合體病毒優(yōu)秀的復制能力。

PCV2主要的基因型有2a、2b、2c、2d和2e。1996年到2000年初，PCV2a是臨床感染豬中最流行的基因型。2003年之后，PCV2b占主導地位。PCV2d首次在2010年報道于中國，近些年，PCV2d已成為臨床上主要的流行基因型。商品化PCV2疫苗大多都基于PCV2a和（或）PCV2b生產(chǎn)或構建的全病毒滅活疫苗或亞單位疫苗[2]。在多個免疫攻毒保護試驗中[10]，瑞圓舒?顯示出對當前流行的PCV2d、PCV2a和PCV2b基因型的交叉保護效果。

2 豬肺炎支原體可溶性抗原

在商品化的豬肺炎支原體疫苗或豬圓環(huán)支原體聯(lián)合疫苗中的支原體組分，通常選擇豬肺炎支原體的全菌體，不同菌株（如P5722-3株、J株、P株等）的豬肺炎支原體在發(fā)酵培養(yǎng)后經(jīng)過滅活，加入佐劑配伍，制備成全菌體滅活疫苗[11]。不同的是，瑞圓舒?選擇去除了支原體細胞的可溶性抗原。

豬肺炎支原體是一種菌體較小、無固定形狀的多形性原核生物。豬肺炎支原體的不同菌株之間在基因組、抗原性和蛋白組水平上均呈現(xiàn)多樣性?；蚪M的多樣性使得豬肺炎支原體不同的菌株能夠適應不同的環(huán)境，使它們能夠更好地在宿主上定植，逃逸宿主的免疫反應或躲避藥物引發(fā)的清除。目前，有23個豬肺炎支原體菌株完成了全基因組測序，其中11個完成了組裝和注釋，另12個還沒有完全組裝。豬肺炎支原體的基因組很小，在0.86～0.96 Mb之間，每個基因組中有528～691個蛋白質(zhì)編碼基因。雖然基因組很小，但我們對豬肺炎支原體基因組的了解非常有限，接近30%的基因功能未知。豬肺炎支原體基因中有20%～30%編碼膜蛋白，其中很多蛋白的功能也尚不清楚。疫苗免疫在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于控制豬支原體肺炎，商品化的疫苗主要由滅活的全菌體和佐劑制成，雖然給仔豬接種疫苗能減少豬肺炎支原體感染引起的生產(chǎn)性能損失，提高日增重、改善飼料轉(zhuǎn)化率、降低死亡率、在更短的時間達到上市重、減少上市重的差異、減少呼吸道中豬肺炎支原體病原的數(shù)量、降低流行率和病變程度等，但疫苗免疫不能對臨床癥狀和支原體樣肺部病變提供完全的保護，不能阻止豬肺炎支原體在體內(nèi)的定植。商品化的豬肺炎支原體疫苗起到的部分保護作用的機制還不完全清楚[12]。

在Okada等[13]的研究中，將豬肺炎支原體培養(yǎng)之后，離心，取全細胞沉淀（重懸后的終濃度為1010CCU/0.2 mL）和沒有細胞的培養(yǎng)基上清液（低于101CCU/0.2 mL）分別作為兩個試驗組的疫苗，對照組為BHL培養(yǎng)基（不含豬肺炎支原體），將3組疫苗滅活后接種試驗豬，4周齡首免，6周齡二免，8周齡時對3組試驗豬用豬肺炎支原體攻毒。結果顯示：在攻毒后的4周，檢查試驗豬的肺部病變，對照組中100%的豬（5/5）出現(xiàn)了肺部病變，病變的比例為（12.2±2.2）%，全細胞沉淀組中80%的豬（4/5）出現(xiàn)了肺部病變，病變的比例為（18.7±16.5）%，培養(yǎng)基上清組中60%的豬（3/5）出現(xiàn)了肺部病變，病變的比例為（3.2±3.9）%。在對肺部勻漿進行細菌學檢測后，對照組豬肺炎支原體的濃度為106.2CCU/0.2 mL，全細胞沉淀組為105.8CCU/0.2 mL，培養(yǎng)基上清組為104.2CCU/0.2 mL。該結果說明豬肺炎支原體的培養(yǎng)基上清液能更顯著地減少由豬肺炎支原體引起的肺部病變。同時，該研究發(fā)現(xiàn)主要的豬肺炎支原體特異性抗原（97、89、65、46、42和41 kDa的蛋白等）在全細胞和上清液中都有表達，這些特異性的蛋白可能跟觀察到的保護相關。在隨后的研究中[14]，Okada用鋁佐劑乳化豬肺炎支原體培養(yǎng)基上清液制成疫苗，在3個豬群免疫（A、B、C），A是SPF豬群，B是沒有明顯呼吸道感染癥狀的高健康狀態(tài)豬群，C是有明顯呼吸道感染癥狀的低健康狀態(tài)豬群。在3個豬群中各設立免疫組和對照組，免疫組接種豬肺炎支原體的培養(yǎng)基上清液疫苗，對照組不免疫。結果顯示，在豬群A中，免疫組在二免后的4周內(nèi)檢測到抗體反應，而且這種抗體可以持續(xù)12周。在豬群B和豬群C中，相對于未免疫組，免疫組中的試驗豬有顯著少的肺部病變、更少的豬肺炎支原體定植。而且，在豬群C中，疫苗免疫提升了日增重，改善了料重比，縮短了上市日齡。

Okada等[15]另一項研究表明，相比于不免疫組，接種豬肺炎支原體的培養(yǎng)基上清液疫苗的試驗豬在攻毒后，肺部病變更少，浸潤到氣管的炎性細胞和支氣管周圍的T細胞聚集更少，肺泡灌洗液中的TNF-a也更少，說明疫苗的免疫可能抑制了支原體感染引起的肺部炎癥細胞反應，導致較少的肺部病變。

在碩騰的一項獨立研究中[16]，用3組濃度不同（低、中、高）的豬肺炎支原體細胞沉淀與PCV1-2嵌合體病毒制成聯(lián)苗，免疫試驗豬后用豬肺炎支原體攻毒，攻毒后剖檢查看肺部病變的比例和范圍，評價針對豬肺炎支原體感染的免疫保護作用。結果如表1顯示，攻毒后，T02組、T03組、T04組試驗豬出現(xiàn)肺部病變的比例和病變范圍較T01對照組沒有減少，說明無論濃度高低，只使用豬肺炎支原體細胞沉淀，都不能對豬肺炎支原體的感染起保護作用。

表1 不同濃度豬肺炎支原體細胞沉淀與PCV1-2嵌合體聯(lián)用后的免疫攻毒試驗

因此，在瑞圓舒?的研發(fā)過程中，為了保證支原體抗原組分的安全性和更準確的免疫應答，采取了“無菌體”的抗原形式，減少疫苗成分中的總生物質(zhì)，減少了動物機體對疫苗中不必要成分的無效應答。

3 A蛋白層析技術

在瑞圓舒?的研發(fā)和生產(chǎn)工藝中，用到的一個核心工藝就是A蛋白層析技術。豬肺炎支原體培養(yǎng)困難，受多種因素影響，如血清的種類及濃度、培養(yǎng)基的成分、生產(chǎn)種子的接種密度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速、通氣量等，豬肺炎支原體的高密度生產(chǎn)受到發(fā)酵工藝的限制。血清是豬肺炎支原體發(fā)酵培養(yǎng)的重要營養(yǎng)物質(zhì)，常用的血清種類有豬血清、牛血清和馬血清，而豬血清比牛血清和馬血清的支原體發(fā)酵滴度更高。有研究表明，在同等濃度下，豬血清的支原體發(fā)酵滴度是牛血清的3倍，是馬血清的5.3倍，因此豬血清對豬肺炎支原體的生長繁殖發(fā)揮著重要的作用[17]。但豬血清中通常會含有PCV2的抗體和其他雜蛋白，如果要構建豬圓環(huán)肺炎支原體的二聯(lián)疫苗，必須要考慮清除這些抗體的影響，因為聯(lián)合疫苗是由多種抗原成分聯(lián)合配制而成，在對其進行質(zhì)量控制研究時應考慮聯(lián)合疫苗各組分間的相互作用，對疫苗中的每一個種類都應單獨檢測其效力。如果不去除豬肺炎支原體抗原組分中的PCV2抗體，當與圓環(huán)抗原組分聯(lián)合時，PCV2抗體會部分阻斷圓環(huán)抗原，影響圓環(huán)抗原組分的免疫效力，以及對圓環(huán)抗原組分效力檢測造成干擾。碩騰的科學家在研發(fā)瑞圓舒?時，曾嘗試在培養(yǎng)豬肺炎支原體時不添加血清或使用不含PCV2抗體的血清，甚至不使用豬肺炎支原體培養(yǎng)基上清液（因含有大量PCV2抗體及其它無關IgG抗體），只使用豬肺炎支原體細胞沉淀，效果都不盡如人意。

A蛋白是金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A, SpA）的簡稱。A蛋白可以與人及多種哺乳動物的IgG的Fc片段發(fā)生可逆的特異性結合，且不影響IgG與抗原的結合活性，因此也稱為“生物海綿”。這一免疫學特性使得A蛋白廣泛應用于抗體的檢測、分離純化等領域，如在單抗藥物工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中，A蛋白親和色譜填料通常用于從細胞培養(yǎng)液中高效捕獲抗體蛋白。金黃色葡萄球菌本身是一種致病力較強的病原菌，A蛋白作為重要的獨立因子存在于90%以上的金黃色葡萄球菌菌株中，直接從菌株細胞壁上分離得到的A蛋白存在安全隱患，且蛋白收率較低，目前市場上用到的A蛋白絕大多數(shù)是從基因工程化的大腸桿菌中分離純化得到。在單抗的工業(yè)生產(chǎn)中，由于填料價格昂貴，A蛋白親和色譜步驟的成本占整個下游加工成本的30%～50%[18]。

將A蛋白技術應用于瑞圓舒?的生產(chǎn)工藝中，A蛋白對豬肺炎支原體發(fā)酵培養(yǎng)液中的PCV2抗體和其他無關IgG抗體有強結合作用，使豬肺炎支原體抗原組分中僅含有支原體可溶性的抗原，在不影響圓環(huán)抗原使用效價和檢測效價的情況下與圓環(huán)抗原組分相容，獲得了聯(lián)合疫苗的成功。以A蛋白作為親和配基的親和色譜具有高度選擇性和親和力，在生物下游純化工藝中表現(xiàn)出眾多的突出優(yōu)勢，但高額的成本給生物制品企業(yè)帶來較大的經(jīng)濟負擔，A蛋白技術在獸用疫苗領域使用的報道極為少見。碩騰公司通過改良和創(chuàng)新，將這種先進的純化工藝應用到豬圓環(huán)支原體二聯(lián)疫苗中，為其他獸用聯(lián)合疫苗的研發(fā)和工藝提供了新的思路。

4 Metastim佐劑

滅活疫苗通常要添加佐劑提高其免疫原性。佐劑是一種非特異性的免疫增強劑，與疫苗抗原配伍使用，可以輔助特異性抗原進入機體，增強機體對特異性抗原的免疫應答。佐劑可以幫助減少疫苗接種頻次、減少抗原量、改善免疫反應質(zhì)量、改善疫苗配方穩(wěn)定性等。常見的疫苗佐劑有鋁鹽佐劑、油乳佐劑、細胞因子佐劑、免疫刺激復合物佐劑、納米佐劑、動植物性來源的佐劑、細菌來源佐劑、核酸佐劑等[19]。在瑞圓舒?中，用到的佐劑是碩騰專有的Metastim佐劑，這是一種基于脂質(zhì)的水包油佐劑，又稱為SP油。Metastim佐劑對多種抗原有效，包括滅活的細菌和病毒、活病毒、類毒素、質(zhì)粒DNA和重組蛋白。

佐劑可以增強動物機體對抗原的免疫反應，佐劑的作用和重要性在疫苗的研發(fā)中經(jīng)常被低估。現(xiàn)有的動物疫苗佐劑越來越多，也越來越復雜，作用機制多，但很多都處于未知階段。佐劑可通過延長抗原對機體的暴露時間、提高抗原遞呈效率、驅(qū)動免疫應答的方向來發(fā)揮作用。但對于聯(lián)合疫苗，包含的抗原是不同的，大小和復雜性不同（如細菌和病毒），機體對抗原產(chǎn)生的免疫應答類型是不同的（如體液免疫和細胞免疫），一種佐劑對一種抗原有效，未必對另一種抗原有效，因此，篩選出一種對聯(lián)合疫苗中所有抗原組分都有效的佐劑也是聯(lián)苗研發(fā)中一個巨大的挑戰(zhàn)。在瑞圓舒?研發(fā)過程中，進行了不同佐劑的體外毒性測定、體內(nèi)安全性測定，及與二聯(lián)苗配伍后，進行PCV2和豬肺炎支原體的免疫攻毒保護試驗（體內(nèi)效力測定），最后根據(jù)安全性和效力，選擇最適合瑞圓舒?的佐劑。在Bubolz等[20]的研究中，將PCV1-2嵌合體病毒、豬肺炎支原體可溶性抗原與不同佐劑配伍，T01組為對照組（生理鹽水），T02組為二聯(lián)苗+Metastim佐劑，T03組為二聯(lián)苗+5% Amphigen佐劑，T04組為二聯(lián)苗+5%Amphigen佐劑+5% SLCD佐劑。在第1組試驗中，將3周齡仔豬分為4組，每組16頭，分別接種4種疫苗（T01～T04），6周齡時對各組試驗豬用PCV2攻毒，9周齡時剖檢。檢測各組試驗豬攻毒前后的病毒血癥、鼻腔，糞便排毒、解剖后淋巴組織病變及PCV2定植情況。結果如圖1顯示：攻毒后，相比對照組（T01），3組免疫組都能顯著降低PCV2病毒血癥；攻毒后7 d和14 d，T02組和T04組比T03組有顯著低的病毒血癥。說明T02組和T04組針對圓環(huán)的感染有更好的保護作用。在第2組試驗中，將3周齡仔豬分為4組，每組16頭，分別接種4種疫苗（T01～T04），6周齡時對各組試驗組用豬肺炎支原體攻毒，10周齡時剖檢，檢測各組試驗豬剖檢時的肺部病變。結果顯示，對照組（T01）試驗豬的平均肺部病變比例是13.1%，T02組為4.3%，T03組為4.7%，T04組為12.0%，說明T02組和T03組針對支原體的感染有更好的保護作用。綜合以上兩組試驗，T02組（Metastim佐劑組）對兩種病原的感染都能起到保護作用。

Metastim佐劑在牛、馬和豬的疫苗中使用多年。Metastim能夠誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，但這種活性機制尚不完全清楚。在Horohov等[21]的研究中，分別用Metastim佐劑、磷酸鋁佐劑和生理鹽水和滅活的馬流感病毒配伍后進行試驗馬多個部位的皮內(nèi)接種，在注射后的不同時間進行活檢。結果顯示，相比與鋁佐劑，含有Metastim佐劑的疫苗能夠產(chǎn)生更多的IFN-γ、IL-12、CD4和CD83；Metastim除了能誘導產(chǎn)生Th2細胞因子外，相比與鋁佐劑，能產(chǎn)生更多的Th1免疫反應。鋁鹽佐劑通常優(yōu)先刺激體液免疫，基于脂質(zhì)的佐劑（Metastim）通常在刺激細胞免疫方面更有效。

基于以上的抗原選擇和工藝特點，通過安全性試驗（如臨床觀察、注射部位反應、過敏反應、直腸溫度等），針對豬肺炎支原體感染的保護試驗（如肺部病變和血清學），針對PCV2感染的保護試驗（如病毒血癥、鼻腔排毒、糞便排毒、組織病理學、細胞免疫、血清學等）確定Metastim與抗原成分的最小免疫劑量，確定最終的疫苗配方。

5 結語

本文介紹了瑞圓舒?的研發(fā)和工藝中所用到的創(chuàng)新技術，首先是抗原的選擇，PCV1-2嵌合體種毒穩(wěn)定、培養(yǎng)效率高、抗原構象完整、豬源細胞培養(yǎng)沒有外源抗原，豬肺炎支原體抗原去除支原體細胞、保留可溶性抗原、安全性更好、免疫應答更精準；A蛋白技術去除不必要的生物原料，解決了兩種抗原兼容性的問題；專有的Metastim佐劑對兩種抗原均有效；最后通過工藝的優(yōu)化實現(xiàn)相應的大規(guī)模生產(chǎn)。

目前，商品化豬用聯(lián)合疫苗的種類還不是很多，但從業(yè)者對聯(lián)苗的需求眾多。聯(lián)苗更方便、省時省力、減少因多次接種疫苗對豬只造成的應激、減少交叉污染、減少疾病傳播風險，利于生物安全防控。未來的豬用聯(lián)合疫苗一是往多種病原、多種價次的聯(lián)合疫苗發(fā)展，一針防多病，簡化豬群復雜而頻繁的免疫程序；二是聯(lián)合疫苗將優(yōu)化各個組分的形式和含量，明確各組分的作用，評估各個抗原組分間的相互作用；三是通過對佐劑工藝的優(yōu)化，開發(fā)出適用于多種抗原的佐劑，明確佐劑的作用機理，適當調(diào)整相應抗原含量，在保證有效性的同時獲得最佳的安全性。除了安全性和有效性，還需關注聯(lián)合疫苗在田間應用的場景，比如免疫程序的兼容性，各個單苗接種時間不同是聯(lián)合疫苗研發(fā)中面臨的另一大挑戰(zhàn)。