張文茂 陳卓 穆紅香 彭贊平

自閉癥為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，對(duì)患兒的社交功能造成較大不良影響，且本病在我國(guó)的發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，是臨床控制需求極高的一類(lèi)疾病。而對(duì)自閉癥進(jìn)行機(jī)制研究，有助于治療靶點(diǎn)篩選，因此是臨床研究的重點(diǎn)[1-2]。微生物群落-腸道-腦軸作為近年來(lái)在自閉癥研究中的一個(gè)重要方面，較多研究認(rèn)為腸道菌群可通過(guò)影響腦腸軸來(lái)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。有研究顯示，患兒糞便中的對(duì)甲酚含量較高，且其含量與自閉癥癥狀密切相關(guān)，而對(duì)甲酚降解菌可降解對(duì)甲酚，可通過(guò)腦腸軸進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)自閉癥實(shí)現(xiàn)治療的作用[3-5]。故本研究探究對(duì)甲酚降解菌誘導(dǎo)自閉癥小鼠行為變化及對(duì)微生物群落-腸道-腦軸的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

將2022 年1—2 月的20 只孤獨(dú)癥譜系障礙模型（Black and Tan Bachyuric-T+tf/J，BTBR-T+tf/J）近交系小鼠隨機(jī)分為研究組（對(duì)甲酚降解菌干預(yù)組）10 只和對(duì)照組（空白質(zhì)粒大腸桿菌組）10 只，其均于小鼠出生3 周斷奶后進(jìn)行研究，其中研究組的體質(zhì)量18～22 g，平均（20.12±0.98）g；對(duì)照組的體質(zhì)量18～22 g，平均（20.06±1.01）g。另選取10 只3 周昆明（Kunming，KM）小鼠為空白組，18～22 g，平均（20.16±0.96）g。三組小鼠均雌雄各半，且三組的體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

研究符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。動(dòng)物飼養(yǎng)和操作條件依據(jù)《湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》[6]要求嚴(yán)格執(zhí)行。動(dòng)物房室內(nèi)溫度控制18～26℃，相對(duì)濕度40%～60%。獨(dú)立通氣籠具飼養(yǎng)，按12 h 光照12 h 黑暗交替光源。墊料經(jīng)高溫滅菌消毒處理，飲用水為煮沸冷涼自來(lái)水，常規(guī)飼料熱量為3.51 kCal/g，研究組的小鼠每2 天1 次，連續(xù)服用1 個(gè)月：1×1010cfu 新鮮培養(yǎng)的對(duì)甲酚降解菌；對(duì)照組每2 天1 次，連續(xù)服用1 個(gè)月：1×1010cfu 新鮮培養(yǎng)的空白質(zhì)粒大腸桿菌。實(shí)驗(yàn)期間每日更換墊料（代謝籠除外），飲水喂食按實(shí)驗(yàn)要求。均飼養(yǎng)8 周。

1.3 觀察指標(biāo)

比較三組的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（曠場(chǎng)試驗(yàn)、理毛實(shí)驗(yàn)、大理石包埋實(shí)驗(yàn)及三箱實(shí)驗(yàn)）結(jié)果及微生物群落-腸道-腦軸指標(biāo)[糞便活菌數(shù)、腸道組織過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）、海馬組織核因子相關(guān)因子-2（NF-E2-related factor，2Nfr-2）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）]。

（1）曠場(chǎng)試驗(yàn)：采用邊長(zhǎng)為45 cm 的正方形敞箱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分成16 個(gè)小正方形，中間4 個(gè)小正方形為中央?yún)^(qū)域，將實(shí)驗(yàn)小鼠置入中央?yún)^(qū)域，采用追蹤系統(tǒng)軟件（格羅貝爾生物科技有限公司，型號(hào)：ANYmaze）對(duì)小鼠在敞箱內(nèi)的移動(dòng)距離、中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間及移動(dòng)速度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)時(shí)間為5 min[7]。（2）理毛實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)小鼠置入干凈整潔的籠子內(nèi)，統(tǒng)計(jì)其20 min內(nèi)的理毛次數(shù)[8]。（3）大理石包埋實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)小鼠置入鼠籠，鼠籠中鋪設(shè)新鮮的墊料，放入直徑1.5 cm 大理石彈珠，將實(shí)驗(yàn)小鼠放入30 min，計(jì)算被埋藏的大理石彈珠[9]。（4）三箱實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)小組置于三個(gè)箱體中，三個(gè)箱體之間有活動(dòng)門(mén)，實(shí)驗(yàn)前將小鼠放入中間箱體自由活動(dòng)10 min，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠放入左右兩個(gè)箱體，實(shí)驗(yàn)小鼠置入中間箱體，記錄10 min，統(tǒng)計(jì)小鼠在每個(gè)箱體的停留及嗅探時(shí)間，進(jìn)行箱體偏好系數(shù)[（小鼠箱體時(shí)間-物體箱體時(shí)間）/（小鼠箱體時(shí)間+物體箱體時(shí)間）]及嗅探時(shí)間偏好系數(shù)[（小鼠嗅探時(shí)間-物體嗅探時(shí)間）/（小鼠嗅探時(shí)間+物體嗅探時(shí)間）]的計(jì)算[10]。（5）糞便活菌數(shù)：分別在第 3、4、5、6、7 周采集小鼠糞便，采用平板活菌計(jì)數(shù)法進(jìn)行糞便活菌數(shù)的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目為雙歧桿菌、乳桿菌及厭氧菌總數(shù)。（6）飼養(yǎng)8 周后采集腸道組織及大腦組織，進(jìn)行腸道組織CAT、MDA 及TAC，海馬組織Nfr-2 及SOD 的檢測(cè)，采用電動(dòng)勻漿儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司，型號(hào)：HTY-761）制備勻漿，采用每項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

空白組的曠場(chǎng)試驗(yàn)顯著優(yōu)于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

表1 三組的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

2.2 三組的理毛實(shí)驗(yàn)及大理石包埋實(shí)驗(yàn)比較

空白組的理毛實(shí)驗(yàn)及大理石包埋實(shí)驗(yàn)顯著優(yōu)于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組的理毛實(shí)驗(yàn)及大理石包埋實(shí)驗(yàn)比較（）

表2 三組的理毛實(shí)驗(yàn)及大理石包埋實(shí)驗(yàn)比較（）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

2.3 三組的三箱實(shí)驗(yàn)比較

空白組的三箱實(shí)驗(yàn)顯著優(yōu)于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組的三箱實(shí)驗(yàn)比較（%，）

表3 三組的三箱實(shí)驗(yàn)比較（%，）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

2.4 三組的糞便活菌數(shù)比較

空白組的糞便活菌數(shù)顯著高于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 三組的糞便活菌數(shù)比較（cfu/g，）

表4 三組的糞便活菌數(shù)比較（cfu/g，）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

2.5 三組的腸道組織CAT、MDA 及TAC 比較

空白組的腸道組織CAT 及TAC 顯著高于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著高于對(duì)照組，腸道組織MDA 顯著低于研究組及對(duì)照組，研究組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 三組的腸道組織CAT、MDA 及TAC 比較（）

表5 三組的腸道組織CAT、MDA 及TAC 比較（）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

2.6 三組的海馬組織Nfr-2 及SOD 比較

空白組的海馬組織SOD 顯著高于研究組及對(duì)照組，研究組則顯著高于對(duì)照組，Nfr-2 顯著低于研究組及對(duì)照組，研究組顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 三組的海馬組織Nfr-2 及SOD 比較（）

表6 三組的海馬組織Nfr-2 及SOD 比較（）

注：t1、P1 為研究組與對(duì)照組比較；t2、P2 為研究組與空白組比較；t3、P3 為對(duì)照組與空白組比較。

3 討論

臨床中與自閉癥相關(guān)的研究中，微生物群落-腸道-腦軸方面的研究日益增多，較多研究認(rèn)為，腸道微生態(tài)的失衡可能是導(dǎo)致自閉癥發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，對(duì)腸道微生態(tài)失調(diào)的干預(yù)與調(diào)控可能是治療本病的有效方式之一[12]。腦腸軸作為腦、腸之間的雙相生理通信網(wǎng)絡(luò)，腸道菌群可通過(guò)影響腦腸軸來(lái)達(dá)到影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，因此認(rèn)為微生物介導(dǎo)可能會(huì)對(duì)自閉癥起到一定的治療干預(yù)作用。有研究顯示[13]，自閉癥患兒的腸道對(duì)甲酚含量顯著升高，且其含量與自閉癥癥狀呈正相關(guān)，因此對(duì)自閉癥患兒進(jìn)行治療的過(guò)程中，通過(guò)降解對(duì)甲酚來(lái)達(dá)到調(diào)控腦腸軸的方式，對(duì)疾病進(jìn)行控制與改善的研究意義較高。而對(duì)甲酚降解菌可對(duì)對(duì)甲酚起到降解的作用[14]，因此認(rèn)為，對(duì)甲酚降解菌可能與自閉癥起到一定的影響作用，但是相關(guān)方面的研究相對(duì)不足。

本研究結(jié)果顯示，空白組小鼠的上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及微生物群落-腸道-腦軸指標(biāo)指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)甲酚降解菌干預(yù)及空白質(zhì)粒大腸桿菌干預(yù)的小鼠，而對(duì)甲酚降解菌干預(yù)的小鼠，上述方面的檢測(cè)與評(píng)估結(jié)果均顯著優(yōu)于空白質(zhì)粒大腸桿菌干預(yù)的小鼠（P＜0.05），因此認(rèn)為對(duì)甲酚降解菌誘導(dǎo)自閉癥小鼠行為變化的優(yōu)勢(shì)較為突出，且可對(duì)微生物群落-腸道-腦軸相關(guān)方面的檢測(cè)指標(biāo)具有較好的改善作用，因此對(duì)于自閉癥的治療與改善效果較好。分析原因，對(duì)甲酚降解菌通過(guò)降解對(duì)甲酚來(lái)達(dá)到影響腸道狀態(tài)的作用，進(jìn)而影響到腸道菌群失衡的情況[15]，而這一與改善腸道組織CAT、MDA 及TAC 具有積極的作用，有助于調(diào)控其抗氧化失衡的情況，進(jìn)而影響到腦部，表現(xiàn)為海馬組織Nfr-2 及SOD 表達(dá)的改善，而這是其神經(jīng)保護(hù)作用中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，而上述幾個(gè)方面均有助于改善自閉癥的狀態(tài)[16]，因此小鼠的相關(guān)行為變化更為突出。

綜上所述，研究認(rèn)為對(duì)甲酚降解菌可改善自閉癥小鼠的相關(guān)行為，可能為通過(guò)影響微生物群落-腸道-腦軸來(lái)達(dá)到影響疾病的目的。此文的研究結(jié)果為自閉癥后期標(biāo)準(zhǔn)制定提供了借鑒內(nèi)容。