趙柳婭 印杰 張建中 翁靜艷

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科 上海 200032）

氯地松乳膏為復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院自制制劑，以氯霉素和醋酸地塞米松為主藥成分，輔料為輕質(zhì)液狀石蠟、甘油、白凡士林、單硬脂酸甘油酯等[1]，臨床上主要用于神經(jīng)性皮炎、接觸性皮炎、慢性濕疹、局限性瘙癢癥等證，效果良好。氯地松乳膏中含氯霉素1%和醋酸地塞米松0.025%，氯霉素對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和厭氧菌均具抗菌作用[2]，制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅要求測定氯霉素的含量，方法為紫外分光光度計(jì)一階導(dǎo)數(shù)法，其影響因素較多；《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）（2020年版二部）收載的氯霉素及其制劑的含量測定方法均為高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）法，該法具有重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道氯霉素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中易水解，從而影響抗菌活性[5]，并且存貯和使用過程中遇到溫度升高可能會(huì)導(dǎo)致氯地松乳膏成分的改變，從而影響其使用安全，因此，氯地松乳膏的說明書指出保存條件為遮光、密閉保存。為確保制劑的安全、有效，本文參考《中國藥典》（2020年版二部）氯霉素含量測定方法及相關(guān)文獻(xiàn)方法[6-8]，考察氯霉素受存儲(chǔ)條件的影響情況，為氯地松乳膏存儲(chǔ)條件提供合理化建議，保證產(chǎn)品在有效期內(nèi)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器

Aglient 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；超聲波清洗儀（必能信超聲有限公司）；水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（立德泰勀科學(xué)儀器有限公司）；LRH-150生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；MJ-150-Ⅰ霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；冰箱（博西家用電器中國有限公司）；DJ-Ⅱ型均質(zhì)器（上海炳隆機(jī)電設(shè)備有限公司）；Milliflex Plus微生物過濾系統(tǒng)（美國默克集團(tuán)）。

1.2 試藥

試藥氯地松乳膏（批號(hào)：L-061901、L-031901、L-012701、L-030601、L-030602、L-030603，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院制劑室）；氯霉素對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.4%）；氯霉素二醇物對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度99.5%）；甲醇（美國天地有限公司）為色譜純，其余試劑為分析純；磷酸（永華化學(xué)科技有限公司）；三乙胺（永華化學(xué)科技有限公司）；1-庚烷磺酸鈉（永華化學(xué)科技有限公司）；磷酸二氫鉀（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（上海盛思生化科技有限公司）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（上海盛思生化科技有限公司）。

菌種金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、白色假絲酵母、黑曲霉、銅綠假單胞菌，來源均為中國藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：Aglient 5TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.01 mol/L 1-庚烷磺酸鈉緩沖溶液（取磷酸二氫鉀6.8 g，用0.01 mol/L 1-庚烷磺酸鈉溶液溶解并稀釋至1 000 mL，再加三乙胺5 mL，用磷酸調(diào)pH至2.5）-甲醇（68∶32，V/V）；檢測波長：277 nm；流速：1.0 mL/min ；柱溫 25 ℃ ；進(jìn)樣量 ：10 μL。

1.3.2 溶液的制備

1）對(duì)照品溶液的制備 精密稱取氯霉素對(duì)照品10.28 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為102.98 μg/mL的氯霉素對(duì)照品溶液；精密稱取氯霉素二醇物對(duì)照品10.50 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得濃度為10.45 μg/mL的氯霉素二醇物對(duì)照品溶液。

2）供試品溶液的制備 精密稱取氯地松乳膏 0.5 g，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲30 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液。

3）陰性樣品溶液 按處方配制缺少氯霉素的陰性樣品，并按上述供試品溶液的制備的操作配制陰性樣品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)

分別吸取溶劑、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下的色譜條件測定，記錄色譜圖（圖1）。由圖1可知，制劑中存在的雜質(zhì)不干擾氯霉素的測定。

圖1 HPLC圖

2.2 線性關(guān)系考察

精密稱取氯霉素對(duì)照品25.9 mg，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為氯霉素對(duì)照品貯備液。精密量取上述氯霉素對(duì)照品貯備液適量并用甲醇稀釋制得濃度分別為5.149、10.298、20.596、102.98、205.96、514.89 μg/mL的系列溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以氯霉素峰面積為縱坐標(biāo)（y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝1 759.284 3x+7.778 8（r＝1.000 0）。結(jié)果表明，氯霉素檢測質(zhì)量濃度在5.15～514.89 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液適量，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定。結(jié)果顯示，氯霉素峰面積的RSD＝0.74%，說明儀器的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液適量，于室溫下放置，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、10、16、22、24 h時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，氯霉素峰面積的RSD＝0.64%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量基本穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品適量，共6份，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，RSD＝1.8%，表明本方法的重復(fù)性較好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取氯地松乳膏空白基質(zhì)0.5 g，按已知量的80%、100%、120% 3個(gè)濃度加入氯霉素對(duì)照品。按供試品溶液的制備方法分別處理低中高濃度各3份樣品共9份，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率（表1）。

2.7 樣品含量測定

取3批氯地松乳膏，按1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，平行制備2份，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積計(jì)算氯霉素的含量（表2）。

表2 氯地松乳膏樣品中氯霉素含量測定

2.8 制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8.1 性狀

肉眼觀察醫(yī)院制劑氯地松乳膏0、1、2、3、6、9、12個(gè)月的外觀性狀。結(jié)果氯地松乳膏在12個(gè)月內(nèi)外觀無明顯變化。

2.8.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則[9]，結(jié)合醫(yī)院制劑的特殊性，將氯地松乳膏樣品（L-061901、L-031901、L-012701）按現(xiàn)有包裝在溫度（30±2）℃，RH（65%±5%）條件下放置，分別于第0、1、2、3、6個(gè)月取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢查，各檢測項(xiàng)目與0個(gè)月數(shù)據(jù)比較，氯地松乳膏中氯霉素含量下降較明顯且超出規(guī)定范圍。

表3 不同批號(hào)氯地松乳膏加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.9 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則[9]，結(jié)合醫(yī)院制劑的特殊性，將氯地松乳膏樣品（L-061901、L-031901、L-012701）按現(xiàn)有包裝在溫度（5±3）℃冷處貯存條件下放置，分別于第0、3、6、9、12個(gè)月取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測，檢驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目進(jìn)行檢查，各檢測項(xiàng)目與0個(gè)月?lián)容^無顯著性變化，均符合規(guī)定。

表4 不同批號(hào)氯地松乳膏長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.10 微生物限度檢查

按《中國藥典》（2020年版四部）通則1105、1106、1107的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法進(jìn)行[9]，于0、3、6、9、12個(gè)月分別檢查供試品中需氧菌、霉菌和酵母菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

本試驗(yàn)參考《中國藥典》（2020年版二部）中的氯霉素含量測定方法，借助HPLC法建立了一種操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的分析方法，為氯地松乳膏中氯霉素含量測定提供了理論依據(jù)。我院制劑氯地松乳膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定的方法是紫外分光光度計(jì)一階導(dǎo)數(shù)法，由于一階導(dǎo)數(shù)法干擾因素較多，準(zhǔn)確度不高，現(xiàn)改為高效液相色譜法測定其含量。本方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，適用于本品的含量測定，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了參考。

外觀性狀檢查表明，氯地松乳膏在12個(gè)月觀察期內(nèi)無明顯變化，因?yàn)樗怯桶腿楦鄤?，失水不明顯；但加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)表明，本制劑對(duì)貯藏溫度較為敏感，在常溫下不穩(wěn)定，其有效分成的含量有一定的變化。文獻(xiàn)報(bào)道，氯霉素易水解生產(chǎn)氯霉素二醇物，氯霉素的分解產(chǎn)物氯霉素二醇物隨溫度升高和放置時(shí)間的延長，其含量也隨之升高；在冷處貯存氯地松乳膏相對(duì)穩(wěn)定[9]。氯地松乳膏原貯藏條件為遮光、密閉保存，現(xiàn)建議修改為遮光、密閉、在冷處貯存。同時(shí)，建議對(duì)氯地松乳膏的配制工藝進(jìn)行改進(jìn)，如添加輔料吐溫80增加氯霉素的穩(wěn)定性[10]、對(duì)氯霉素進(jìn)行環(huán)糊精包合[11]等方法進(jìn)一步提高其質(zhì)量穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究以制劑性狀、氯地松乳膏中氯霉素的含量變化、微生物限度等項(xiàng)目為指標(biāo)，考察了氯地松乳膏的穩(wěn)定性，為制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高、有效期的確定及貯存條件的改進(jìn)提供了參考依據(jù)。